Development and validation of LC-MS/MS methods for the simultaneous quantification of sofosbuvir and its major metabolite (GS-331007) in blood plasma and cerebrospinal and seminal fluid: Application to a pilot clinical trial with a focus on Zika.

Zika still poses a threat to global health owing to its association with serious neurological conditions and the absence of a vaccine and treatment. Sofosbuvir, an anti-hepatitis C drug, has shown anti-Zika effects in animal and cell models. Thus, this study aimed to develop and validate novel LC-MS/MS methods for the quantification of sofosbuvir and its major metabolite (GS-331007) in human plasma and cerebrospinal (CSF) and seminal fluid (SF), and apply the methods to a pilot clinical trial. The samples were prepared by liquid-liquid extraction and separated using isocratic mode on Gemini C18 columns. Analytical detection was performed using a triple quadrupole mass spectrometer equipped with an electrospray ionization source. The validated ranges for sofosbuvir were 0.5-2,000 ng/mL (plasma) and 0.5-100 ng/mL (CSF and SF), while for the metabolite they were 2.0-2,000 ng/mL (plasma), 5.0-200 ng/mL (CSF) and 10-1,500 ng/mL (SF). The intra-day and inter-day accuracies (90.8-113.8%) and precisions (1.4-14.8%) were within the acceptance range. The developed methods fulfilled all validation parameters concerning selectivity, matrix effect, carryover, linearity, dilution integrity, precision, accuracy and stability, confirming the suitability of the method for the analysis of clinical samples.

Cynomolgus monkeys are successfully and persistently infected with hepatitis E virus genotype 3 (HEV-3) after long-term immunosuppressive therapy.

Epidemiological studies found that hepatitis E virus genotype 3 (HEV-3) infection was associated with chronic hepatitis and cirrhosis in immunocompromised patients. Our study aimed to investigate the relationship between the host immunosuppressive status and the occurrence of HEV-related chronic hepatitis. Here we describe a successful experimental study, using cynomolgus monkeys previously treated with tacrolimus, a potent calcineurin inhibitor immunosuppressant, and infected with a Brazilian HEV-3 strain isolated from naturally infected pigs. HEV infected monkeys were followed up during 160 days post infection (dpi) by clinical signs; virological, biochemical and haematological parameters; and liver histopathology. The tacrolimus blood levels were monitored throughout the experiment. Immunosuppression was confirmed by clinical and laboratorial findings, such as: moderate weight loss, alopecia, and herpes virus opportunistic infection. In this study, chronic HEV infection was characterized by the mild increase of liver enzymes serum levels; persistent RNA viremia and viral faecal shedding; and liver histopathology. Three out of four immunosuppressed monkeys showed recurrent HEV RNA detection in liver samples, evident hepatocellular ballooning degeneration, mild to severe macro and microvesicular steatosis (zone 1), scattered hepatocellular apoptosis, and lobular focal inflammation. At 69 dpi, liver biopsies of all infected monkeys revealed evident ballooning degeneration (zone 3), discrete hepatocellular apoptosis, and at most mild portal and intra-acinar focal inflammation. At 160 dpi, the three chronically HEV infected monkeys showed microscopic features (piecemeal necrosis) corresponding to chronic hepatitis in absence of fibrosis and cirrhosis in liver parenchyma. Within 4-months follow up, the tacrolimus-immunosuppressed cynomolgus monkeys infected with a Brazilian swine HEV-3 strain exhibited more severe hepatic lesions progressing to chronic hepatitis without liver fibrosis, similarly as shown in tacrolimus-immunosuppressed solid organ transplant (SOT) recipients. The cause-effect relationship between HEV infection and tacrolimus treatment was confirmed in this experiment.

Desenvolvimento e validação de metodologias para determinação de sofosbuvir e seu principal metabólito (GS-331007) em plasma, líquor e fluido seminal por LC-MS

O Zika vírus (ZIKV) ainda é uma ameaça à saúde global, pois, até o momento, inexiste medicamento e vacina, podendo causar severos comprometimentos neurológicos como microcefalia e Síndrome de Guillain-Barré (SGB). Apesar da principal via de transmissão ser a picada do mosquito Aedes, a transmissão sexual da doença merece ser considerada devido à grande persistência viral em fluido seminal. Recentes publicações (2017 - 2020) sinalizaram resultados promissores com o sofosbuvir, um antiviral para Hepatite C. Então, esta pesquisa objetivou desenvolver e validar metodologias (conforme Resolução da ANVISA para validação de metodologias bioanalíticas, RDC nº 27 de 17 de maio de 2012 ) por LC-MS/MS para apurar a concentração de sofosbuvir e seu principal metabólito (GS-331007) em plasma, líquor e fluido seminal humanos e aplicar as metodologias na análise de amostras de um ensaio clínico piloto pioneiro com foco em Zika. O ensaio foi realizado em duas etapas, sendo coletadas amostras nos tempos de 01h:30min e 5h:00min após a administração de um comprimido do medicamento Sovaldi® (400 mg de sofosbuvir). As análises foram realizadas utilizando colunas C18 com a fase móvel composta por solução aquosa de ácido fórmico 0,1 % e metanol:acetonitrila (80:20, v/v). As quantificações foram realizadas em modo positivo utilizando a estratégia de padronização interna. As seguintes relações m/z foram monitoradas: sofosbuvir m/z 530.1>242.8; GS-331007 m/z 260.9>112.9; cimetidina m/z 253.2>117.2 (padrão interno); zidovudina m/z 267.9>127.0 (padrão interno) e diazepam m/z 285.2>193.0 (padrão interno). Previamente à injeção no sistema, as amostras foram extraídas com éter etil-terc- butílico e acetato de etila conforme procedimento desenvolvido e validado. Para quantificação, foram empregadas as seguintes curvas de calibração ponderadas 1/x2 (ng/mL): plasma - 0,50 ­ 2000 para o sofosbuvir e 2 ­ 2000 para o GS-331007; líquor - 0,50 ­ 100 para o sofosbuvir e 5 ­ 200 para o GS-331007; fluido seminal - 0,50 ­ 100 para o sofosbuvir e 10 ­ 1500 para o GS-331007. As metodologias seguiram as especificações da Resolução da ANVISA e foram aplicadas com sucesso ao ensaio piloto.

Desenvolvimento e validação de metodologia bioanalítica por LC-MS

A hepatite C é uma doença causada pelo vírus da hepatite C (HCV) e acomete pessoas em todo o mundo. O Relatório Global sobre as Hepatites (2017) publicado pela Organização Mundial de Saúde (OMS), estima que, em 2015, havia 71 milhões portadores de hepatite C crônica. No Brasil, a estimativa é que 1,4 a 1,7 milhões de pessoas são afetadas pelo vírus HCV. A hepatite C e outras hepatites virais constituem um grande problema global de saúde pública e precisam ser erradicadas. Atualmente, não existe vacina para a hepatite C. Logo, a prevenção e o tratamento são importantes ferramentas no combate à doença. Segundo a OMS, apenas 5,5 milhões de pessoas receberam tratamento para a hepatite C e o número de pessoas que receberam tratamento com antivirais de ação direta é ainda menor: apenas meio milhão de pessoas. Estes fármacos de ação direta incluem o sofosbuvir, o ledipasvir, o daclatasvir e outros compostos os quais são melhor tolerados e mais efetivos. Este trabalho objetivou desenvolver e validar uma metodologia bioanalítica para quantificar o sofosbuvir em plasma humano segundo as diretrizes da Resolução RDC nº 27 de 17/maio/2012, o guia de validação de métodos bioanalíticos editado pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) e aplicar o método a um estudo de farmacocinética na população brasileira. Uma metodologia utilizando a extração líquido-líquido com éter metil terc-butílico/acetato de etila (70:30) v/v foi desenvolvida e empregada para extrair o sofosbuvir e o padrão interno cimetidina da matriz biológica. A análise foi executada utilizando uma coluna Gemini® NX C18 4,6 mm x 50,0 mm, 5µm de tamanho de partícula (Phenomenex®, Torrence, USA) A separação cromatográfica foi realizada utilizando uma fase móvel composta por (solvente A) 0,1 % ácido fórmico em água e (solvente B) metanol/acetonitrila (80:20) v/v, solvente A/solvente B (30:70) v/v. O tempo de corrida foi de 2,5 min. A detecção ocorreu por espectrometria de massas utilizando a técnica de varredura denominada monitoramento de reações mútliplas (MRM). As transições selecionadas para análise foram m/z 529,9>242,8 para o sofosbuvir e m/z 253,0>116,9 para a cimetidina. A faixa linear de trabalho utilizada neste trabalho foi de 0,50-1000,00 ng/mL de sofosbuvir em plasma. As curvas de calibração foram construídas aplicando-se a regressão linear utilizando o método dos mínimos quadrados com a ponderação de 1/x2. Uma vez que o método foi desenvolvido e validado, ele pode ser aplicado no estudo de farmacocinética após a administração oral de 400 mg de sofosbuvir em 69 voluntários. O sangue foi coletado em 22 tempos de coleta pré-determinados: 0h:00 min, 0h:05 min, 0h:10 min, 0h:15 min, 0h:20 min, 0h:30 min, 0h:40 min, 0h:50 min, 01h:00 min, 01h:15 min, 01h:30 min, 01h:45 min, 02h:00 min, 02h:30 min, 03h:00 min, 03h:30 min, 04h:00 min, 04h:30 min, 05h:00 min, 06h:00 min, 08h:00 min and 10h:00 min. Então, foram obtidos os parâmetros farmacocinéticos do sofosbuvir na população brasileira os quais, para a surpresa dos autores, mostraram grandes diferenças quando comparados a outras populações