Ensaios moleculares quantitativos e baseados em temperatura de dissociação do DNA para diagnóstico específico da infecção por Leishmania spp

RESUMO

A leishmaniose é uma doença negligenciada, presente na Europa, Ásia, África e nas Américas, abrangendo infecções assintomáticas e duas formas clínicas principais Leishmaniose Visceral (LV) e Leishmaniose Tegumentar (LT). É causada por protozoários do gênero Leishmania, transmitidos pela fêmea de flebotomíneos vetores. Sabe-se que as diferentes espécies de Leishmania estão associadas às diferentes formas clínicas da doença e ao seu prognóstico. O diagnóstico da leishmaniose é feito a partir da combinação de dados clínicos, epidemiológicos e laboratoriais, mas principalmente através do isolamento e cultivo dos parasitos, que pode ser seguido de ensaio de isoenzimas para identificação da espécie. Este processo, contudo, tem baixa eficiência, além de demandar tempo e recursos que podem ser minimizados com a utilização de abordagem molecular diretamente em material clínico. A técnica de PCR em tempo real (qPCR) tem sido amplamente utilizada para detecção da infecção por Leishmania e para a quantificação da sua carga parasitária, por se tratar de uma metodologia simples, rápida e extremante sensível, capaz de detectar concentrações muito baixas de parasitos presentes em uma amostra A análise de curvas de dissociação por High Resolution Melting (HRM) tem como principal vantagem permitir investigar toda a região amplificada pelos iniciadores e tem sido utilizada para a identificação de espécies por apresentar uma sensibilidade capaz de identificar diferenças de até um nucleotídeo entre sequências de DNA. A realização de um estudo que estabeleça uma metodologia capaz de detectar e identificar espécies de Leishmania, e que inclua uma validação analítica para uma padronização adequada e permita a determinação da carga parasitária em paralelo, para possibilitar a associação desses dados, ainda se faz necessária. Assim, o objetivo deste trabalho é estabelecer uma metodologia baseada em qPCR e HRM, que dispense o isolamento e cultivo do parasito, e que permita a detecção, identificação de espécies de Leishmania e a quantificação da carga parasitária diretamente em material clínico. Para isso, as metodologias de qPCR e HRM foram padronizadas com cepas de referência e posteriormente validadas com amostras clínicas de pacientes de Rondônia, Brasil, diagnosticados com leishmaniose cutânea, sendo realizada a quantificação da carga parasitária por qPCR e a identificação da espécie envolvida por HRM. Os resultados apontam que o alvo HSP70 é melhor indicado para determinar a carga parasitária de Leishmania. Além disso, estabelecemos um algoritmo para a identificação das principais espécies de Leishmania de relevância clínica por HRM, a partir da combinação de dois alvos moleculares, HSP70 e COI.