RESUMEN
Metacaspases are cysteine proteases present in plants, fungi, prokaryotes, and early branching eukaryotes, although a detailed description of their cellular function remains unclear. Currently, three-dimensional (3D) structures are only available for two metacaspases: Trypanosoma brucei (MCA2) and Saccharomyces cerevisiae (Yca1). Furthermore, metacaspases diverged from animal caspases of known structure, which limits straightforward homology-based interpretation of functional data. We report for the first time the identification and initial characterization of a metacaspase of Nicotiana tabacum L., NtMC1. By combining domain search, multiple sequence alignment (MSA), and protein fold-recognition studies, we provide compelling evidences that NtMC1 is a plant metacaspase type II, and predict its 3D structure using the crystal structure of two type I metacaspases (MCA2 and Yca1) and Gsu0716 protein from Geobacter sulfurreducens as template. Analysis of the predicted 3D structure allows us to propose Asp353, at the putative p10 subunit, as a new member of the aspartic acid triad that coordinates the P1 arginine/lysine residue of the substrate. Nevertheless, site-directed mutagenesis and expression analysis in bacteria and Nicotiana benthamiana indicate the functionality of both Asp348 and Asp353. Through the co-expression of mutant and wild-type proteins by transient expression in N. benthamiana leaves we found that polypeptide processing seems to be intramolecular. Our results provide the first evidence in plant metacaspases concerning the functionality of the putative p10 subunit.
Asunto(s)
Ácido Aspártico/química , Caspasas/química , Caspasas/metabolismo , Nicotiana/enzimología , Secuencia de Aminoácidos , Ácido Aspártico/metabolismo , Sitios de Unión , Caspasas/genética , ADN Complementario , Escherichia coli/genética , Modelos Moleculares , Datos de Secuencia Molecular , Mutagénesis Sitio-Dirigida , Proteínas de Plantas/química , Proteínas de Plantas/metabolismo , Conformación Proteica , Pliegue de Proteína , Subunidades de Proteína , Proteínas de Saccharomyces cerevisiae/química , Alineación de Secuencia , Nicotiana/genética , Trypanosoma brucei brucei/enzimologíaRESUMEN
Las técnicas biotecnológicas contribuyen positiva y significativamente en los programas de propagación, conservación y mejoramiento de las especies vegetales. Dentro de éstas, el cultivo de tejidos, el desarrollo de mapas de ligamientos genéticos y de QTLs y la detección de genes de interés han demostrado ser de gran utilidad para los mencionados propósitos. En este sentido, se estandarizó una técnica para la multiplicación in vitro de la forma silvestre de guayabo en tres fases de cultivo: establecimiento, multiplicación de propágulos y enraizamiento. La misma constituye una vía de utilidad para la propagación, la conservación de germoplasma y el mejoramiento genético en la especie. Además, se estandarizó un método de conservación a corto-mediano plazo. Por otra parte, se construyó un mapa de ligamiento genético para la especie empleando marcadores AFLP y SSR. Los 11 grupos del mapa de ligamiento genético y los 50 QTLs relacionados con caracteres vegetativos y de calidad interna y externa del fruto, constituyen el punto de partida para el clonaje de genes de interés agrícola y la implementación futura de la selección asistida por marcadores en el guayabo. De igual forma, las 176 secuencias candidatas a genes de resistencia (RGL) y del desarrollo de la planta (MADS-box y HOMEO-box) detectadas pueden ser de gran utilidad en la saturación del mapa de ligamiento referido, el estudio de la variabilidad presente en el cultivo, así como en la solución de problemas relacionados con el rendimiento, la producción y la resistencia a estrés biótico y abiótico
Biotechnologies contribute positively and signifi¬cantly in the propagation, conservation and breeding programs of many plant species. From them, tissue culture, linkage maps and QTLs detection for interesting genes have been proved to be of great utility for these purposes. In this sense, a technique for in vitro multiplication of wild guava was standardized in three culture phases: establishment, multiplication and rooting. This technique constituted a useful way for propagation, germplasm conservation and genetic breeding in the specie. A method for short-medium term conservation was also standardized. On the other hand, a genetic linkage map was constructed for the specie using AFLP and SSR markers. The 11 groups of the genetic linkage map and the 50 QTLs related with vegetative and internal/external fruit characters constitute the starting point for genes cloning of agricultural interest and the future imple¬mentation of markers assisted selection in guava. Also, the 176 candidate sequences for resistance-gene-like (RGL) and plant development (MADS-box and HOMEO-box) genes detected can be of great utility in linkage map saturation, variability studies in this crop, as well as in the solution of problems rela¬ted with yielding and resistance to biotic and abiotic stresses.