Melittin-induced metabolic changes on the Madin-Darby Bovine Kidney cell line / [Mudanças metabólicas induzidas por melitina em células da linhagem Madin-Darby Bovine Kidney]

In this study, the toxic effects of melittin on Madin-Darby Bovine Kidney cells (MDBK) were analyzed with respect to mitochondrial functionality by reduction of MTT and flow cytometry, apoptosis potential, necrosis, oxygen reactive species (ROS) production, lipid peroxidation, and DNA fragmentation using flow cytometry and cell membrane destabilization by confocal microscopy. The toxicity presented dose-dependent characteristics and mitochondrial activity was inhibited by up to 78.24 ±3.59% (P<0.01, n = 6) in MDBK cells exposed to melittin (10µg/mL). Flow cytometry analysis revealed that melittin at 2µg/mL had the highest necrosis rate (P<0.05) for the cells. The lipoperoxidation of the membranes was also higher at 2µg/mL of melittin (P<0.05), which was further confirmed by the microphotographs obtained by confocal microscopy. The highest ROS production occurred when the cells were exposed to 2.5µg/mL melittin (P<0.05), and this concentration also increased DNA fragmentation (P<0.05). There was a significative and positive correlation between the lipoperoxidation of membranes with ROS (R=0.4158), mitochondrial functionality (R=0.4149), and apoptosis (R=0.4978). Thus, the oxidative stress generated by melittin culminates in the elevation of intracellular ROS that initiates a cascade of toxic events in MDBK cells.(AU)

Neste estudo, os efeitos tóxicos da melitina em células Madin-Darby Bovine Kidney (MDBK) foram analisados quanto à funcionalidade mitocondrial, por redução de MTT e citometria de fluxo, potencial de apoptose, necrose, produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), peroxidação lipídica e fragmentação de DNA, utilizando-se citometria de fluxo e desestabilização da membrana celular, por microscopia confocal. A toxicidade apresentou características dose-dependentes e a atividade mitocondrial foi inibida até 78,24±3,59% (P<0,01, n = 6) em células MDBK expostas à melitina (10µg/mL). Análises por citometria de fluxo revelaram que a melitina a 2µg/mL apresentou o maior índice necrótico celular (P<0,05). A maior lipoperoxidação de membranas também foi na concentração de 2µg/mL de melitina (P<0,05), o que foi posteriormente confirmado por microscopia confocal. A maior produção de ROS aconteceu quando as células foram expostas a 2,5µg/mL de melitina (P<0,05), e essa concentração também aumentou a fragmentação de DNA (P<0,05). Houve uma significativa correlação positiva entre a lipoperoxidação de membranas e a produção de ROS (R=0,4158), funcionalidade mitocondrial (R=0,4149) e apoptose (R=0,4978). Portanto, o estresse oxidativo gerado pela melitina culminou na elevação de ROS intracelular, que inicia uma cascata de eventos tóxicos nas células MDBK.(AU)

Apamin-induced alterations in J774 1. 6 macrophage metabolism / [Alterações induzidas por apamina no metabolismo de macrófagos J774 1. 6]

Among the immune system cells, macrophages have an important role. Apamin, a bee venom constituent, is important in the defense of these insects. Thus, we aimed to evaluate the metabolism of J774 1.6 macrophage cell line when exposed to isolated and purified apamin, using cytotoxicity tests by MTT reduction and analysis by flow cytometry (apoptosis / necrosis, production of reactive oxygen species (ROS), membranous lipoperoxidation (LPO), electrical potential of the mitochondrial membrane (mMP) and DNA fragmentation). None of the tested concentrations (10 to 100µg/mL) were cytotoxic according to MTT reductions. Apoptosis rates decreased at concentrations of 2.5, 5.0, and 10.0µg/mL (P<0.05), while necrosis rates increased (P<0.05). However, rates of healthy cells at the highest tested concentration (10µg/mL) did not differ from control (P>0.05). Apamin did not alter ROS, LPO, or DNA fragmentation. Therefore, all analyzed concentrations (1.25 to 10µg/mL) decreased mMP. Such decrease in apoptosis might be due to a suppression of mitochondrial pro-apoptotic messengers, as this peptide causes no oxidative stress, lipid peroxidation, and DNA damage. Highly sensitive techniques are majorly important for proper interpretation of cellular toxicity mechanisms, combined with routine laboratory methods.(AU)

Das células do sistema imunológico, macrófagos desempenham um papel fundamental. Apamina, constituinte do veneno de abelhas, é importante na defesa destas. Objetivou-se avaliar o metabolismo da linhagem de macrófagos J774 1.6 expostos à apamina isolada e purificada, avaliando-se citotoxicidade por redução de MTT e análise por citometria de fluxo (apoptose / necrose, produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), lipoperoxidação membranosa (LPO), potencial elétrico da membrana mitocondrial (MMP) e fragmentação do DNA). Nenhuma concentração testada (10 a 100µg / mL) foi citotóxica. As taxas de apoptose diminuíram nas concentrações 2,5, 5,0 e 10,0µg / mL (P<0,05), enquanto as de necrose aumentaram (P<0,05). Entretanto, as taxas de células saudáveis na maior concentração testada (10µg / mL) não diferiram do controle (P>0,05). A apamina não alterou as ERO, a LPO nem a fragmentação do DNA. Portanto, todas as concentrações analisadas (1,25 a 10µg / mL) diminuíram a mMP. Tal diminuição na apoptose pode ser por uma supressão de mensageiros pró-apoptóticos mitocondriais, já que este peptídeo não causa estresse oxidativo, peroxidação lipídica nem dano ao DNA. Técnicas altamente sensíveis são importantes para adequada interpretação dos mecanismos de citotoxicidade.(AU)

Construction and characterization of a recombinant vaccine encoding the nucleocapsid protein gene of avian infectious bronchitis virus / Construção e caracterização de uma vacina recombinante codificando o gene da proteina do nucleocapsideo do virus da bronquite infecciosa das galinhas

A vacinação é a forma mais utilizada para prevenir a bronquite infecciosa causada pelo vírus da bronquite infecciosa das galinhas (IBV). Contudo, as vacinas convencionais são incapazes de diferenciar aves infectadas de vacinadas. No presente trabalho foi construído, caracterizado, e avaliado como candidato vacinal, um adenovírus recombinante expressando o gene N do IBV. O gene N foi clonado em um adenovírus humano tipo 5 defectivo e transfectado para as células HEK-293A para gerar rAd5_N. Após o vetor ser obtido como esperado e a confirmação da expressão da proteína N em HEK-293ª, foi realizada inoculação pela via oculo-nasal na dose de 10 7 TCID 50 /0,1mL para imunização de galinhas livres de patógenos específicos (SPF). A resposta imunológica do Ad5_N e a proteção contra o desafio ao IBV foram avaliadas e comparadas com uma vacina viva comercial. Não foram detectados anticorpos anti-IBV em aves vacinadas com o Ad5_N. A vacina comercial induziu anticorpos detectáveis a partir do 7º dia pós-vacinal. Em aves vacinadas com o Ad5_N não houve aumento na expressão de IFNγ. Neste estudo, o rAd5_N obtido não conferiu proteção contra desafio com IBV-M41. Os resultados indicam a necessidade de avaliar adenovírus recombinantes expressando outros genes do IBV.(AU)

Infecção latente pelo herpesvírus bovino tipo 1 em búfalos (Bubalus bubalis) no Rio Grande do Sul / Bovine herpesvirus type 1 latent infection in buffalo (Bubalus bubalis) in Rio Grande do Sul

Apesar dos bovinos serem considerados os hospedeiros naturais do BoHV-1, estudos sorológicos têm sugerido que búfalos podem ser suscetíveis ao BoHV-1 e a outros alfa-herpesvírus geneticamente relacionados. O objetivo deste estudo foi detectar a presença de DNA viral de BoHV-1 em 202 amostras de gânglios trigêmeos de búfalos, pela técnica de semi-nested PCR, para detecção de um segmento do gene codificante da glicoproteína D (gD) do BoHV-1. Além disso, 242 amostras de soro foram analisadas pela técnica de soroneutralização (SN) para a detecção de anticorpos neutralizantes contra BoHV-1, BoHV-5 e BuHV. Todas as amostras clínicas foram coletadas em um matadouro na cidade de Pelotas, RS, Brasil. O DNA de BoHV-1 foi detectado em 61 (30,1%) gânglios, e os resultados da SN demonstraram que 27,6% dos animais apresentaram anticorpos contra, pelo menos, um dos vírus testados. O sequenciamento genômico e a análise de 14 amplicons confirmaram a presença do DNA do BoHV-1 nos tecidos analisados. Em resumo, os resultados indicam que o BoHV-1 está distribuído em rebanhos bubalinos provenientes da região Sul do Brasil. Entretanto, são necessárias investigações adicionais, no sentido de elucidar o papel exato dos búfalos na epidemiologia das infecções pelo BoHV-1.(AU)

Although bovines are natural hosts for BoHV-1, serologic studies in several countries have suggested that buffaloes (Bubalus bubalis) may be susceptible to BoHV-1 and other genetically related alphaherpesvirus. This study aimed to investigate the presence of BoHV-1 DNA in trigeminal ganglia from 202 buffaloes by a semi-nested PCR to amplify partially the glycoprotein D (gD) gene of BoHV-1. Additionally, 242 serum samples were tested by serum neutralization (SN) for the detection of antibodies against BoHV-1, BoHV-5 and BuHV. All clinical samples were collected in a slaughterhouse located in Pelotas, RS, Brazil. BoHV-1 DNA was detected in 61 (30.1%) of the samples and SN revealed 27.6% of the animals with neutralizing antibodies against at least one of the tested viruses. Nucleotide sequencing of 15 amplicons followed by BLAST analysis confirmed the presence of BoHV-1 DNA in the analyzed tissues. Taken together, these data indicate that BoHV-1 infection is distributed in buffaloes in southern Brazil. However, the role of buffaloes in the BoHV-1 epidemiology needs further investigation.(AU)

Chemical and cytotoxic analyses of three varieties of Brazilian propolis (green propolis, jataí propolis and brown propolis) and its anti-Sporothrix brasiliensis in vitro activity / [Análises químicas e citotóxicas de três variedades de própolis brasileiras (própolis verde, própolis jataí e própolis marrom) e sua atividade in vitro anti-Sporothrix brasiliensis]

In this study, we described the antifungal activity of three Brazilian propolis extracts: brown, green and from jataí bees against Sporothrix brasiliensis. The extracts were obtained from ethanolic extraction and their chemical composition was determined by high-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry. The cellular toxicity was measured in MDBK (Madin-Darby Bovine Kidney) cells and quantified by the MTT assay (3- (4,5 dimethylthiazol-2yl -2,5-diphenyl-2H bromine tetrazolato). For antifungal activity, the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum fungicidal concentration (MFC) were determined by broth microdilution. The results showed that cell toxicity was not observed at lower concentrations (0.097 to 0.39μg/ml) for all extracts in comparison to cell control. Among the chemical compounds identified, caffeic acid, p-coumaric acid, chlorogenic acid, ferulic acid and rutin were quantified. In antifungal activity, green and jataí did not exhibit activity against the isolates (MIC and MFC greater than 0.78mg/ml). However, all isolates of S. brasiliensis were sensitive to brown propolis (MIC of 0.09 to 0.78mg/ml), including the standard strain (P<0.001). Among the Brazilian propolis studied, the brown propolis showed activity against the S. brasiliensis isolates and more studies should be undertaken in order to evaluate its promising use in the treatment of sporotrichosis.(AU)

Neste estudo, descreveu-se a atividade antifúngica de três extratos de própolis brasileiras: marrom, verde e de abelhas jataí (Tetragonisca angustula), contra Sporothrix brasiliensis. Os extratos foram obtidos de extração etanólica, e a sua composição química foi determinada por cromatografia líquida de alta eficiência, acoplada à espectrometria de massa. A toxicidade celular foi medida em células MDBK (Madin-Darby Bovine Kidney), avaliada por observação microscópica e quantificada pelo ensaio MTT (3- (4,5-dimetiltiazol-2-ilo -2,5-difenil-2H bromo tetrazolato). Para a atividade antifúngica, determinou-se a concentração inibitória mínima (CIM) e a concentração fungicida mínima (CFM) por meio de microdiluição em caldo. Os resultados mostraram que a toxicidade celular não foi observada em concentrações menores (0,097 a 0,39μg/ml). Entre os compostos químicos identificados, foram quantificados o ácido cafeico, ácido p-cumárico, ácido clorogênico, ácido ferúlico e a rutina. Na atividade antifúngica, as própolis verde e jataí não apresentaram atividade contra os isolados (CIM e CFM maior que 0,78mg/ml), porém todos os isolados de S. brasiliensis foram sensíveis à própolis marrom (CIM de 0,09 a 0,78mg/ml), incluindo a cepa padrão (P<0,001). Entre as própolis brasileiras estudadas, a marrom mostrou atividade contra S. brasiliensis, e mais estudos devem ser realizados para avaliar seu uso promissor no tratamento da esporotricose.(AU)

Ocorrência do subtipo B do vírus da imunodeficiência felina em gatos domésticos da região sul do estado do Rio Grande do Sul, Brasil / Occurrence of subtype B of the feline immunodeficiency virus in domestic cats from the south region of Rio Grande do Sul state, Brazil

No Brasil existem poucos estudos sobre a ocorrência da infecção pelo vírus da imunodeficiência felina (FIV), assim como a determinação dos subtipos circulantes, o que é indispensável para o desenvolvimento de vacinas e novos testes diagnósticos. O presente trabalho investigou a ocorrência da infecção pelo FIV entre os anos de 2010 e 2011 em gatos domésticos submetidos a atendimento clínico na cidade de Pelotas e região. Amostras de sangue total de 70 animais, incluindo suspeitos (28) ou não suspeitos (42) da infecção pelo FIV, foram submetidas à reação de PCR nested. Os resultados indicaram uma frequência de infecção de 15,7% (11/70) e a análise dos fatores associados (sexo, idade e condição clínica) evidenciou uma maior ocorrência em gatos com idade superior a 10 anos e acometidos por infecções crônicas e recidivantes. Oito amostras positivas na PCR nested foram submetidas a sequenciamento genômico e somente o subtipo B foi detectado na região estudada.

In Brazil there are few studies on the occurrence of the feline immunodeficiency virus (FIV) infection and its subtypes, which are essential for the development of vaccines and new diagnostic tests. The present study investigated the occurrence of the FIV infection between 2010 and 2011 in domestic cats submitted to medical attendance in the city of Pelotas and nearby area. Total blood samples of seventy cats, suspected (28) or not (42) of infection by FIV were analyzed by nested PCR in order to perform a diagnosis. The results pointed to a FIV infection frequency of 15.7% (11/70) and the analysis of the risk factors related to infection (sex, age and clinical condition) evidenced a greater occurrence in cats up to 10 years of age with chronic and recurrent infections. Eight samples found positive by nested PCR were submitted to DNA sequencing indicating that only the subtype B was detected in the studied region.

Isolation and characterization of canine parvovirus type 2c (CPV-2c) from symptomatic puppies

Canine parvovirus type 2 (CPV-2) is a leading cause of diarrhea in puppies in several parts of the world. In this study CPV-2 was detected and recovered from puppies showing clinical disease from Montevideo, Uruguay. Samples were processed and used to infect CRFK and MDCK cells in order to isolate the virus. Out of twelve, two samples were positive for CPV-2. A genomic region of 583 bp was amplified and the molecular characterization was performed by sequencing, phylogenetic analysis and Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP). Two isolated viruses (UY1 and UY2) were CPV-2c-like viruses. The comparison between the cytophatic effect (CPE) of CPV-2 (vaccinal virus) and CPV-2c (isolated virus) on primary canine cells cultures and on CRFK line cells, demonstrated that CPV-2c is less citopathogenic in CRFK than in primary cultures. Our study represents the first report on isolation and characterization of canine parvovirus type 2c (CPV-2c) in cell cultures from South American dogs.

Serum survey for antibodies to coronavirus, herpesvirus, calicivirus, and parvovirus in domestics cats from Rio Grande do Sul, Brazil / Inquérito sorológico para anticorpos contra coronavírus, herpesvírus, calicivírus e parvovírus em gatos domésticos do Rio Grande do Sul, Brasil

A ocorrência da infecção por coronavírus felino (FCoV), herpesvírus felino tipo 1 (FHV-1), calicivírus felino (FCV) e parvovírus felino (FPV) foi investigada mediante a detecção de anticorpos no soro de 97 gatos domésticos de Pelotas, RS, pelo teste de soro-neutralização. Entre os animais estudados, 51 não eram vacinados, 11 haviam sido vacinados contra FHV-1, FCV e FPV com pelo menos uma dose, e 35 tinham histórico de vacinação desconhecido. Foram detectados anticorpos para o FCoV em 75,2% (73/97) dos gatos. Anticorpos contra o FHV-1 estavam presentes em 38,1% (37/97): 73% (8/11) dos gatos vacinados, 39,2% (20/51) dos não vacinados e 25,7% (9/35) dos gatos com histórico de vacinação desconhecido. Anticorpos para o FCV estavam presentes em 56,7% (55/97): 81,8% (9/11) dos gatos vacinados, 52,9% (27/51) dos não vacinados, e 54,3% (19/35) dos gatos com histórico de vacinação desconhecido. Para o FPV, havia anticorpos em 69,1% (67/97): 100% (11/11) dos vacinados, 66,6% (34/51) dos não vacinados e 62,8% (22/35) dos gatos com histórico de vacinação desconhecido. Os resultados sugerem alta exposição ao FCoV, FHV-1, FCV e FPV na população de gatos na área estudada.

Níveis de anticorpos contra o vírus da cinomose canina e o parvovírus canino em cães não vacinados e vacinados / Antibodies levels against canine distemper virus and canine parvovirus in vaccinated and unvaccinated dogs

Antibody titres to canine distemper virus (CDV) and canine parvovirus (CPV) were measured in 132 dogs: 80 had been vaccinated at least once, 22 had not been vaccinated, and 30 had unknown vaccination history. Serum antibody titers were measured by means of serum neutralization (CDV) or hemagglutination inhibition (CPV). Serum CDV titers >20 and serum CPV titers >80 were considered protective. Protective antibodies to CDV were present in 40.1 percent of the population: 39.8 percent of the vaccinated dogs, 31.8 percent unvaccinated, and in 46.6 percent of the dogs with unknown vaccination history. Protective antibodies to CPV were present in 90.9 percent of the dogs: 93.7 percent of the vaccinated dogs, 90.9 percent of the unvaccinated, and 83.3 percent of the dogs with unknown vaccination history.

Otimização da imunoistoquímica para detecção de herpesvírus bovino tipo 5 (BHV-5) em tecidos do sistema nervoso central fixados com formaldeído / Optimization of immunohistochemistry for Bovine Herpesvirus 5 (BHV-5) detection on formalin-fixed tissues of the central nervous system

Com o objetivo de otimizar a técnica de imunoistoquímica para detecção de herpesvírus bovino tipo 5 (BHV-5) em tecidos do sistema nervoso central fixado em formaldeído, foram avaliados diferentes métodos de digestão enzimática, diferentes anticorpos e reagentes para bloqueio de reações inespecíficas. As reações apresentaram a máxima intensidade de coloração específica e a quantidade mínima de coloração de fundo quando foram usadas protease de Streptomyces griseus (0,1%) ou proteinase K de Tritirachium album limber (0,05%), mediante incubação durante 15 minutos a 37ºC. Entre os anticorpos monoclonais analisados, dois foram capazes de detectar BHV-5. As reações inespecíficas foram bloqueadas mais efetivamente pela incubação do tecido com caseína (0,5%), durante cinco minutos, ou leite em pó (2,5%), durante 60 minutos, ou soro eqüino (2,5%), durante 60 minutos. Com a técnica otimizada foi possível a detecção de BHV-5 em material de arquivo.

Levantamento sorológico de parvovírus bovino no rebanho leiteiro do RS, Brasil / Serological survey of bovine parvovirus in dairy herds of Rio Grande do Sul State, Brazil

Para determinaçäo da prevalência de animais com anticorpos contra o parvovírus bovino (BVP), e avaliaçäo do nível de imunidade do rebanho leiteiro do Estado do Rio Grande do Sul (RS), foram testadas 4.096 amostras de soro de bovinos. Os animais eram de diferentes idades e provenientes das diversas bacias leiteiras do Estado. As amostras foram examinadas pela técnica de inibiçäo da hemaglutinaçäo. Do total analisado, 4.000 (97,7 por cento) mostraram anticorpos inibidores da hemaglutinaçäo, sendo 2.715 (66,3 por cento) com títulos de anticorpos entre 1:160 e 1:5120. Näo se observou correlaçäo entre idade e título de anticorpos dos animais. As bacias leiteiras n§ 3 (representada pela regiäo de Bagé) e 6 (representada pelos municípios de Erexim e Tapejara, dentre outros) apresentaram animais com os mais altos títulos de anticorpos e a bacia n§ 7 (representada pelos municípios de Colorado, Espumoso, Selbach e Tapera, dentre outros) com os mais baixos títulos. Concluiu-se que o BVP está amplamente disseminado no rebanho leiteiro do RS e pode ser o agente determinante de diarréia neonatal ou de problemas respiratórios e reprodutivos, apesar da maioria dos animais apresentarem alto grau de imunidade humoral contra o vírus