RESUMO
Resumen Introducción: El emicizumab (Hemlibra®, ROCHE) es un anticuerpo monoclonal IgG4 bi-específico, recombinante y humanizado, que mimetiza la función del FVIIIa. Su administración por vía subcutánea es eficaz y segura en la prevención de hemorragias en pacientes con hemofilia A severa con o sin inhibidor. Si bien el emicizumab ha sido aprobado con un régimen de administración basado en el peso corporal y sin un monitoreo de los niveles plasmáticos, la cuantificación plasmática de emicizumab puede ser útil en distintas circunstancias clínicas y de investigación. Debido a que en Argentina aún no están disponibles los calibradores y controles comerciales específicos de emicizumab, hemos validado un método para la cuantificación plasmática de emicizumab (Epc), basado en la medición de FVIII por método coagulométrico en una etapa modificado (modFVIIIcoag), utilizando calibradores y controles preparados "in-house". Materiales y métodos: para la Epc se utilizó una predilución de la muestra 1/80 con buffer Owren Koller. El calibrador "in-house" de emicizumab (150 μg/mL de emicizumab) se preparó agregando emicizumab de 150 mg/ml a un plasma deficiente en FVIII. Se prepararon dos niveles de control "in-house" y una curva de calibración de 6 puntos. Los procedimientos de validación se realizaron en un STA Compact Max2 (Diagnostica Stago). Repetibilidad: se procesaron los controles 20 veces en la misma corrida analítica. Imprecisión Intra-Laboratorio: se procesaron los controles por triplicado durante 5 días. Linealidad:11 niveles medidos por triplicado. Límite de cuantificación: 15 mediciones de un plasma deficiente de FVIII comercial. Bias: a partir de un programa de evaluación externa de calidad (UK NEQAS). Se evaluó la interferencia del FVIII y rFVIIa en Epc, y de emicizumab en otras determinaciones de hemostasia. Resultados: Epc mostró una imprecisión y un sesgo aceptables, un rango lineal de 5-150 µg/ml y un límite de cuantificación de 5 µg/ml de emicizumab. En los estudios de interferencia se encontró que el FVIII interfiere con Epc pero no así el rFVIIa. Emicizumab acortó los valores del TTPa por debajo del límite inferior del intervalo de referencia local, mientras que el FVIII medido por método cromogénico con componentes de origen bovino no fue afectado. El método coagulométrico de una etapa de FVIII fue falsamente aumentado y mostró una fuerte correlación lineal con Epc en este sistema reactivo/instrumento. Discusión: El ensayo modFVIIIcoag automatizado "in-house" permite la cuantificación plasmática de emicizumab mediante un método sencillo, reproducible, de bajo costo y de fácil integración en los procesos de rutina.
Abstract Introduction: Emicizumab (Hemlibra®, ROCHE) is a bispecific, recombinant and humanized IgG4 monoclonal antibody, that mimics the function of FVIIIa. Its subcutaneous administration is effective and safe in preventing bleeding in patients with severe hemophilia A with or without inhibitor. Although emicizumab has been approved with an administration regimen based on body weight and without monitoring of plasma levels, emicizumab plasma quantification may be useful in different clinical and research circumstances. Since emicizumab-specific commercial calibrators and controls are not yet available in Argentina, we have validated a modified one-stage FVIII assay (modOSA) for the quantification of emicizumab in plasma (Epq) using in-house prepared calibrators and controls. Materials and methods: For Epq a 1/80 sample predilution with Owren Koller buffer was used. In house emicizumab calibrator (150 μg/mL emicizumab) was prepared by adding emicizumab 150 mg/mL to FVIII deficient plasma. Two in house control levels and a 6-point calibration curve were prepared. The validation procedures were performed in a STA Compact Max2 analyser (Diagnostica Stago). Repeatability: controls were processed 20 times in the same analytical run. Intra-laboratory Imprecision:controls were processed in triplicate for 5 days. Linearity: 11 levels were measured in triplicate. Limit of quantitation: 15 measurements of a commercial FVIII deficient plasma were assessed. Bias were estimated based on an external quality assessment program (UK NEQAS). The interference of FVIII and rFVIIa in Epq and of emicizumab in other hemostasis determinations were evaluated. Results: Epq showed acceptable imprecision and bias, a linear range of 5-150 µg/ml and a quantification limit of 5 µg/ml. Epq was interfered with FVIII but not with rFVIIa. Emicizumab shortened aPTT values below the lower limit of the local reference interval. FVIII measured by chromogenic method with components of bovine origin was not affected. The one-stage FVIII assay (OSA) was falsely increased but showed a strong linear correlation with Epq in this instrument reagent system. Discussion: The automated "in-house" modOSA allows the plasma quantification of emicizumab using a simple, reproducible, low-cost method that is easy to integrate into routine processes.