RESUMO
The molecular diagnosis of haemophilia A (HA) patients has many benefits including diagnosis confirmation and inhibitor risk development prediction. In female carries of a mutation, the molecular diagnosis allows for genetic counseling and prenatal diagnosis, which have become part of the comprehensive care for HA in many countries. Therefore, the aim of this study was to determine the F8 mutations in severe HA (sHA) patients and female carriers. In 12 patients with sHA, the presence of the intron 22 and intron 1 inversions was investigated using an inverse and a conventional PCR method, respectively. In patients negative for the inversions, the F8 gene was screened through conformation sensitive gel electrophoresis (CSGE) and further sequencing. The causative mutation was successfully identified in 6/12 patients, including the novel mutation p.G190C. The mothers of these six patients and those of seven other sHA patients molecularly diagnosed in a previous work were investigated for the presence of the genetic alterations found in their sons. All mothers were found to be carriers. This is the first study conducted in Venezuela which directly analyzes the F8 gene in potential carrier mothers to specifically identify the presence of the mutation that was detected in their sons, and complements a previous study on sHA patients. Our findings will facilitate the implementation of regular screening of HA carriers in our country and will allow a better care of bleeding symptoms and genetic counseling.
El diagnóstico molecular de pacientes con hemofilia A (HA) tiene múltiples beneficios, incluyendo la confirmación del diagnóstico y la predicción del riesgo de desarrollar inhibidores. En mujeres portadoras de una mutación, el diagnóstico molecular permite el consejo genético y el diagnóstico prenatal, los cuales son parte de la atención integral de HA en muchos países. Así, el objetivo de este estudio fue determinar mutaciones en el gen F8 en pacientes con HA severa (HAs) y en mujeres portadoras. En 12 pacientes con HAs, la presencia de la inversión del intrón 22 y el intrón 1 fue investigada utilizando una PCR inversa y una convencional, respectivamente. En pacientes negativos para cualquiera de las inversiones, el gen del F8 fue analizado a través de la técnica de electroforesis en gel sensible a conformación (CSGE) y posterior secuenciación. La mutación causante de la enfermedad fue identificada en 6/12 pacientes, incluyendo la mutación nueva p.G190C. Las madres de estos seis pacientes y las de otros siete pacientes de HAs diagnosticados en un estudio previo y fueron investigadas para la presencia de alteraciones genéticas encontradas en sus hijos. Todas las madres resultaron ser portadoras. Éste es el primer estudio realizado en Venezuela donde se analiza directamente el gen F8 en portadoras potenciales para identificar específicamente la presencia de una mutación que fue detectada en sus hijos, y complementa un estudio previo con pacientes HAs. Nuestros hallazgos facilitarán la implementación del análisis regular de portadoras de HA en nuestro país y permitirán un mejor cuidado de los síntomas de sangrado y consejo genético.
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Humanos , Masculino , Fator VIII/genética , Hemofilia A/genética , Heterozigoto , Mutação , Índice de Gravidade de DoençaRESUMO
Background: Hemophilia A is an inherited disorder caused by alterations in factor VIII gene (F8) located on the X-chromosome, the intron 22 inversion being the most common mutation. The rest are predominantly point mutations distributed along this large gene of 26 exons. Aim: To implement a molecular diagnostic test to detect mutations in the F8 gene in Chilean patients with Hemophilia A. Material and Methods: To validate the testing methods, we analyzed samples with intron 22 and intron 1 inversion, and with point mutations previously studied, as well as one subject without Hemophilia. We also studied unrelated Chilean patients with Hemophilia A and their female relatives for carrier testing. Intron 22 and intron 1 inversions were studied by long distance polymerase chain reaction (PCR) and point mutations by sequencing the coding and promoter regions of the F8 gene. Results: The results obtained in all samples used for validation were concordant with those obtained previously. In the Chilean patients, the intron 22 inversion and point mutations previously described were observed. In 6 out of 9 patients with mild Hemophilia A we found the same mutation (Arg2159Cys) in exon 23, which has been described as prevalent in mild Hemophilia A. Conclusions: The analysis of intron 22 and intron 1 inversions, as well as of point mutations in the F8 gene will help us to confirm the diagnosis in patients with severe, moderate and mild Hemophilia A, and also it will allow us to perform carrier testing and to provide better genetic counseling.
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Feminino , Humanos , Masculino , Inversão Cromossômica , Fator VIII/genética , Hemofilia A/diagnóstico , Íntrons/genética , Hemofilia A/genética , Triagem de Portadores Genéticos/métodos , Mutação Puntual/genética , Reação em Cadeia da Polimerase/métodosRESUMO
Hemofilia A, uma doença hemorrágica ligada ao cromossomo X, é causada pela deficiência ou disfunção do fator VIII da coagulação (FVIII). A doença resulta de alterações genéticas no gene do fator VIII (F8). Clinicamente, a hemofilia A é caracterizada por hemorragias em diferentes partes do corpo e o tratamento recomendado é a reposição do fator FVIII deficiente. O desenvolvimento de anticorpos inbidores para o FVIII é a principal complicação do tratamento. Estes anticorpos neutralizam a atividade do FVIII e, portanto invalidam a terapia. Os riscos para o desenvolvimento destes anticorpos são multifatoriais e envolvem fatores genéticos e ambientais. O objetivo deste estudo foi determinar as bases moleculares da hemofilia A grave e sua correlação com o desenvolvimento de inibidores em associação com o perfil sorológico par doenças virais. As análises moleculares consistiram da determinação da inversão do íntron 1 e do íntron 22 (inv1 e inv 22), além da determinação de outras alterações genéticas presentes na região codificadora de F8.
Inicialmente, 150 pacientes, com hemofilia A grave (níveis de atividade de fator VIII inferior a 1%) registrados no Hemominas, foram selecionados para este estudo. Nós caracterizamos 50 pacientes, dos quais, 8 tinham inv1, 29 tinham inv22 e os pacientes restantes apresentaram mutações sem sentido, mutações de sentido trocado e mutações de mudança de fase de leitura. Posteriormente, um grupo de 40 pacientes, registrados no hemocentro de Campinas e com diagnóstico molecular (32 tinham inv 22 e os pacientes restantes apresentaram mutações sem sentido, mutações de sentido trocado e mutações de mudança de fase de leitura) foram arrolados em nosso estudo. Informações a cerca de inibidores e perfil sorológico de 90 pacientes foram coletadas a partir de prontuários médicos. Dados moleculares e clínicos foram comparados por meio de análises estatísticas. As análises estatísticas não revelaram uma correlação positiva entre as diferentes categorias de mutação e a presença/ausência de inibidores sob influência do perfil sorológico.
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Masculino , Feminino , Humanos , Criança , Adolescente , Adulto , Fator VIII/genética , Hemofilia A/genética , Íntrons/genéticaRESUMO
Hemofilia A, uma doença hemorrágica ligada ao cromossomo X, é causada pela deficiência ou disfunção do fator VIII da coagulação (FVIII). A doença resulta de alterações genéticas no gene do fator VIII (F8). Clinicamente, a hemofilia A é caracterizada por hemorragias em diferentes partes do corpo e o tratamento recomendado é a reposição do fator FVIII deficiente. O desenvolvimento de anticorpos inbidores para o FVIII é a principal complicação do tratamento. Estes anticorpos neutralizam a atividade do FVIII e, portanto invalidam a terapia. Os riscos para o desenvolvimento destes anticorpos são multifatoriais e envolvem fatores genéticos e ambientais. O objetivo deste estudo foi determinar as bases moleculares da hemofilia A grave e sua correlação com o desenvolvimento de inibidores em associação com o perfil sorológico par doenças virais. As análises moleculares consistiram da determinação da inversão do íntron 1 e do íntron 22 (inv1 e inv 22), além da determinação de outras alterações genéticas presentes na região codificadora de F8.
Inicialmente, 150 pacientes, com hemofilia A grave (níveis de atividade de fator VIII inferior a 1%) registrados no Hemominas, foram selecionados para este estudo. Nós caracterizamos 50 pacientes, dos quais, 8 tinham inv1, 29 tinham inv22 e os pacientes restantes apresentaram mutações sem sentido, mutações de sentido trocado e mutações de mudança de fase de leitura. Posteriormente, um grupo de 40 pacientes, registrados no hemocentro de Campinas e com diagnóstico molecular (32 tinham inv 22 e os pacientes restantes apresentaram mutações sem sentido, mutações de sentido trocado e mutações de mudança de fase de leitura) foram arrolados em nosso estudo. Informações a cerca de inibidores e perfil sorológico de 90 pacientes foram coletadas a partir de prontuários médicos. Dados moleculares e clínicos foram comparados por meio de análises estatísticas. As análises estatísticas não revelaram uma correlação positiva entre as diferentes categorias de mutação e a presença/ausência de inibidores sob influência do perfil sorológico.
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Humanos , Masculino , Feminino , Criança , Adolescente , Adulto , Fator VIII/genética , Hemofilia A/genética , Íntrons/genéticaRESUMO
As hemofilias são doenças hemorrágicas resultantes da deficiência de fator VIII (hemofilia A) ou de fator IX (hemofilia B) da coagulação, decorrentes de mutações nos genes que codificam os fatores VIII ou IX, respectivamente. A hemofilia A é mais frequente que a hemofilia B e acomete aproximadamente 1:10.000 nascimentos masculinos. A gravidade e frequência dos episódios hemorrágicos está relacionado ao nível residual de atividade de fator VIII presente no plasma e este relaciona-se ao tipo de mutação associada à doença. A clonagem do gene do fator VIII tornou possível o conhecimento das bases moleculares da hemofilia A, sendo hoje conhecidas mais de 1.000 mutações associadas à doença. O conhecimento das bases moleculares da hemofilia A permite uma melhor compreensão da relação genótipo-fenótipo da doença, tomada de condutas clínicas diferenciadas em casos de mutações associadas a um maior risco de desenvolvimento de inibidor, determinação da condição de portadora de hemofilia em mulheres relacionadas aos pacientes, implementação de programa de aconselhamento genético/orientação familiar e melhor compreensão das relações estruturais-funcionais do gene-proteína. Este artigo propõe revisar as bases moleculares da hemofilia A, os métodos laboratoriais utilizados para a caracterização das mutações e as implicações clínicas envolvidas no diagnóstico molecular da hemofilia A.
Hemophilias are bleeding disorders due to deficiency of the blood coagulation factor VIII (hemophilia A) or factor IX (hemophilia B), resulting from mutation on the gene coding for factor VIII or factor IX. Hemophilia A is more frequent than hemophilia B and affects 1:10,000 male newborns. The severity and frequency of hemorrhagic episodes is related to residual activity of factor VIII present in the plasma and relates to the type of mutation associated with the disorder. Cloning of the factor VIII gene has enabled researchers to better understand the molecular basis of hemophilia A, accounting to date, for more than 1,000 mutations associated with the disease. This comprehensive knowledge permits an improved comprehension of the genotype-phenotype relation, establishment of clinical policies when mutations related to higher risk of inhibitors development are known, identification of hemophilia carriers in case of women related to patients, implementation of a program of genetic counseling and discovery of structural-functional relationship between gene-protein. This article aims to review the molecular basis of hemophilia A, laboratory techniques used to characterize mutations and clinical implications involved in the molecular diagnosis of hemophilia A.
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Feminino , Humanos , Masculino , Fator VIII/genética , Hemofilia A/genética , Hemofilia A/diagnóstico , MutaçãoRESUMO
We explored the potential of fusion of hepatic locus control region 1 (HCR-1) with HCR-2 to express B-domain-deleted human factor VIII (FVIII) in four cell lines. B-domain-deleted human FVIII expression was controlled by HCR-1/HCR-2, followed by liver specific and ubiquitous promoters. Chimera enhancer HCR-1/HCR-2, followed by cytomegalovirus (CMV) promoter, gave 2-fold more FVIII expression in all cell lines (105.6 ± 2.8 for Hek-293, 68.8 ± 3.8 for HepG2, 34.8 ± 1.3 for CHO, and 27.2 ± 1.6 ng-mL-1-106 cells-1 for L.N.) when compared to the vector with CMV alone (54.8 ± 3.3 for Hek-293, 32.4 ± 1.2 for HepG2, 18.6 ± 1.1 for CHO, and 10.1 ± 1.7 ng-mL-1-106 cells-1 for L.N.). Elongation factor 1-α gene and human CMV promoters were more efficient than the promoters from the human α-1-antitrypsin gene, and fviii was less efficient in hepatic cell lines. HCR-1/HCR-2, followed by strong promoters, increases FVIII expression in vitro. Our results underscore the importance of cis sequences for enhancing in vitro FVIII expression; this may be helpful for designing new strategies to improve heterologous expression systems.
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Humanos , Animais , Elementos Facilitadores Genéticos/genética , Fator VIII/genética , Regiões Promotoras Genéticas/genética , Vetores Genéticos/genética , Linhagem Celular , Linhagem Celular Tumoral , Células CHO , Cricetinae , Cricetulus , Citomegalovirus/genética , Fator VIII/metabolismo , Imuno-Histoquímica , Microscopia de Fluorescência , Plasmídeos , Proteínas Recombinantes de Fusão/genética , Proteínas Recombinantes de Fusão/metabolismo , Proteínas de Fluorescência Verde/genética , Proteínas de Fluorescência Verde/metabolismo , Reação em Cadeia da Polimerase Via Transcriptase ReversaAssuntos
Humanos , Fator VIII/análise , Fator VIII/genética , Fator de von Willebrand/análise , Fator de von Willebrand/genética , Sistema ABO de Grupos Sanguíneos/genética , Sistema ABO de Grupos Sanguíneos/imunologia , Antígenos/sangue , Preservação de Sangue/métodos , Criopreservação , Fator de von Willebrand/metabolismo , Genótipo , Valores de ReferênciaRESUMO
La Hemofilia A es un trastorno heredado de la coagulación sanguínea, que se caracteriza por presentar niveles reducidos de Factor VIII. En pacientes con enfermedad severa, alrededor del 50 por ciento presenta la inversión del intron 22 del gen del FVIII, y en el 5 por ciento ocurre la inversión del intron 1. Además, es posible encontrar otro tipo de mutaciones, tales como, inserciones, deleciones y mutaciones missense y nonsense. Las mutaciones en el gen del FVIII se asocian a riesgo de desarrollar inhibidores del FVIII, los que provocan refractariedad a la infusión de concentrados de factor. Gracias al conocimiento genético de la hemofilia A, se ha mejorado el diagnóstico tanto de pacientes como de portadoras, así como también la producción de concentrados de factor empleados en el tratamiento.
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Humanos , Fator VIII/genética , Hemofilia A/genética , Deleção Cromossômica , Inversão Cromossômica , Fator VIII/antagonistas & inibidores , Duplicação Gênica , Mutação , Polimorfismo GenéticoRESUMO
La hemofilia A (HA) y B (HB) son enfermedades hemorrágicas hereditarias ligadas al sexo causadas por defectos de los factores VIII y IX, respectivamente. Excepto grandes inversiones recurrentes involucradas en la mitad de las HA severas, el resto de las hemofilias son causadas por distintos tipos de mutaciones grandes y pequeñas. Fueron estudiadas 70 familias con HA severa (se), 6 con seHB, 1 con HA moderada-leve (m) y 2 con mHB. Primero, en seHA, se estudio la inversión del intrón 22 (Inv22) usando un nuevo abordaje basado en PCR inversa. En los casos negativos para las inversiones se estudiaron primariamente las grandes deleciones y secundariamente las mutaciones pequeñas. En familias con HA, encontramos la Inv22 en 43 por ciento de las seHAs, una única inversión del intrón 1, 10 grandes deleciones (catorce por ciento)y 23 mutaciones pequeñas (incluyendo 10 deleciones, 3 inserciones, 4 cambios nonsense, 5 missense y 1 de splicing); y en HB, 1 deleción afectando un sitio de splicing, 4 missense y 3 nonsense. Este esquema de caracterización de mutaciones permite un estudio y análisis molecular preciso de HA y HB y beneficiará tanto al asesoramiento genético como a la provisión de información clave para el diseño del tratamiento.
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Humanos , Masculino , Feminino , Fator VIII/genética , Hemofilia A/classificação , Hemofilia A/genética , Hemofilia B/classificação , Hemofilia B/genética , Biologia Molecular , Argentina , Sequência de Bases , Southern Blotting , Deleção Cromossômica , Íntrons/genética , Inversão Cromossômica/genética , Mutação/genética , Polimorfismo Genético , Reação em Cadeia da Polimerase/métodosRESUMO
Hemophilia A and B are X-chromosome linked bleeding disorders caused by deficiency of the respective coagulation factor VIII and IX. Affected individuals develop a variable phenotype of hemorrhage caused by a broad range of mutations within the Factor VIII or Factor IX gene. Here, were report the results of the molecular diagnosis in a five Costa Rican families affected with Hemophilia. Methods of indirect and direct molecular diagnosis are applied in three Hemophilia A and two Hemophilia B families from Costa Rica as well as preconditions, practicability and facilities of this diagnosis. In two families with Hemophilia A and both families with Hemophilia B the causative mutation could be detected by Southern blotting, polymerase chain reaction or sequence analysis. One Hemophilia A family could only analyzed by linkage analysis using genomic markers.
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Humanos , Masculino , Feminino , Fator IX/genética , Fator VIII/genética , Hemofilia A/diagnóstico , Hemofilia B/diagnóstico , Mutação/genética , Costa Rica , Hemofilia A/genética , Hemofilia B/genética , Linhagem , Marcadores Genéticos , Reação em Cadeia da Polimerase , Southern BlottingRESUMO
Desde el aislamiento del gen del factor VIII (FVIII) de coagulación, se ha elucidado una gran variedad de mutaciones causales de la hemofilia A (HemA). La imposibilidad de monitorear todas estas mutaciones, hace que en el laboratorio sólo debamos abocarnos a aquellas más prevalentes. Este es el caso de la inversión del intrón 22 sólo detectada por tecnicas de biología molecular, que constituye la causa del 50 por ciento de las HemA severas. En este artículo, se discuten las ventajas e inconvenientes del uso diagnostico de polimorfismos genéticos ligados y se refieren los aspectos moleculares de la enfermedad, tanto de la proteína como del gen del FVIII. Finalmente, se analizan las prospectivas futuras que están ofreciendo las nuevas tecnologías. La ingeniería genética aporta actualmente, dos tipos de estrategias terapéuticas en hemofilia: el uso de factores de coagulación de origen recombinante, que evita los riesgos de infección grave que introducen los concentrados plasmáticos y la terapia génica, que aunque muy promisoria, aún se encuentra en etapa pre-clínica de experimentación.
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Humanos , Masculino , Fator VIII/genética , Hemofilia A/genética , Inversão Cromossômica , Terapia Genética , Hemofilia A/terapia , Mutação/genéticaRESUMO
Hemophilia A is an X-linked disorder of coagulation caused by a deficiency of factor VIII. A large number of different mutations in the VIII gene have been identified. Thus, the detection of female carriers, depends upon the analysis of DNA polymorphism in and near the factor VIII gene. Our aim was to develop a strategy, earlier reported, for carrier testing in families at risk of hemophilia A. In this study, we analyzed the DNA polymorphisms in 26 affected families, with use of the factor VIII intragenic polymorphisms identified by the restriction enzymes Bcll and AlwNI and by differential hybridization with sequence-specific oligonuclaotide probes recognizing Bcll and AlwNI polymorphisms. While the DNA polymorphism detected by Bcll site in intron 18 of the factor VIII gene was informative for 30 percent families studied, the AlwNI/intron 7 polymorphism provided aditional information (4 percent). The carrier status of the remaining 58 percent could be determined utilizing the other polymorphisms suggested the strategy. The 2 polymorphic sites used combined with the other polymorphisms, intragenic and extragenic, can generate levels of informativeness greater than 98 percent. We concluded that the strategy for carrier testing would be a good alternative in genetic counselling for hemophilia A., but its limitations must be carefully taken into account
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Humanos , Fator VIII/genética , Íntrons/genética , Hemofilia A/genética , Doadores de Sangue , Triagem de Portadores Genéticos , Teste de Complementação Genética/métodosRESUMO
Determinamos as freqüências alélicas de polimorfismos de restriçäo ligados ao gene do fator VIII da coagulaçäo em 95 indígenas provenientes de cinco tribos da Amazônia: Wayampí, Wayana-Apalaí, Kayapó, Arára e Yanománi. Seis sítios polimórficos foram analisados: BclI (intron 18), HindIII (intron 19), XbaI A (intron 22), BglI (intron 25) e dois sítios extragênicos XbaI (XbaI B e XbaI C, localizados a 5' do gene). A distribuiçäo dos polimorfismos do gene do fator VIII em Ameríndios foi similar à observada em populaçöes asiáticas e caucasóides, mas diferiu claramente do padräo observado em negros. A distribuiçäo das freqüências alélicas dos polimorfismos intragênicos BclI, HindIII e XbaI näo diferiu significativamente entre as cinco tribos. Por outro lado, houve heterogeneidade das freqüências alélicas para os sítios BglI e XbaI B e XbaI C, indicando uma possível heterogeneidade entre as tribos ameríndias. Esses resultados se contrapöem à ausência de diversidade observada com a análise dos polimorfismos dos genes das globinas ß-símiles, mas concordam com nosso resultados recentes obtidos através de haplótipos de genes da globina alfa e de 6 VNTRs nas mesma populaçöes. Dessa forma, nossos resultados representam uma evidência adicional da heterogeneidade entre diferentes tribos ameríndias e reforçam a necessidade de se estudar um maior número de sistemas gênicos para uma melhor caracterizaçäo das interrelaçöes genéticas entre essas subpopulaçöes. Demonstra-se, também, que os polimorfismos associados ao gene do fator VIII podem representar uma ferramenta útil em estudos de genética populacional.
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Humanos , Masculino , Feminino , Fator VIII/genética , Polimorfismo Genético , Alelos , Heterogeneidade Genética , Genética Populacional , Indígenas Sul-Americanos/genéticaRESUMO
A identificaçäo de portadores do gene para a hemofilia A foi levada a efeito em 20 famílias de pacientes que apresentavam essa condiçäo. A detecçäo foi realizada com base no estudo dos polimorfismos de restriçäo (RLFP) do gene do fator VIII para as enzimas BcII e HindIII. Os métodos utilizados incluíram a amplificaçäo de fragmentos do gene em análise pela reaçäo em cadeia de polimerase e posterior digestäo com as enzimas específicas. Foram estudados 84 indivíduos pertencentes a 20 famílias de pacientes. Foi possível identificar ou excluir portadoras do gene anormal em 76// das famílias estudadas. Esse traballho evidencia a possibilidade de detecçäo de portadoras na maioria das famílias de pacientes com hemofilia A na populaçäo brasileira com o emprego de um número restrito de polimorfismo de restriçäo