Peste septicémica rápidamente fatal secundaria a peste bubónica primaria inicialmente no diagnosticada: reporte de caso / Rapidly fatal septicemic plague secondary to undiagnosed primary bubonic plague: case report

RESUMEN La peste es una enfermedad reemergente causada por Yersinia pestis. Los humanos generalmente adquieren la enfermedad por picaduras de pulgas. La peste es una enfermedad sistémica fulminante, siendo la peste neumónica la forma más letal. El diagnóstico tardío es una de las principales causas de mortalidad y diseminación de la enfermedad, dado que limita la efectividad de las medidas de control. Presentamos el caso de un varón de 42 años, que previamente había viajado a una zona endémica de peste, y luego presentó hiperpirexia, hipotensión, y adenopatía inguinal inflamatoria. A pesar del cuadro clínico muy característico, nadie (antes del ingreso a nuestro hospital) sospechó peste. Se inició una combinación antibiótica efectiva y tratamiento intensivo recién al quinto día de enfermedad. El paciente evolucionó con shock séptico, falla respiratoria, y muerte. Se confirmó peste por reacción en cadena de polimerasa (PCR). Este caso enfatiza la importancia de tener un alto índice de sospecha para peste.

ABSTRACT Plague is a re-emerging disease caused by the bacteria Yersinia pestis. Humans usually get the disease through the bite of an infected flea. Plague is a fulminant systemic disease, with pneumonic plague being the most lethal form. Late diagnosis is one of the main causes of mortality and spread of the disease, as it limits the effectiveness of control measures. We present the case of a 42-year-old male, who had previously traveled to an endemic plague area and then presented hyperpyrexia, hypotension, and inflammatory inguinal adenopathy. Despite the very characteristic clinical picture, nobody (before admission to our hospital) suspected plague. An effective combination of antibiotics and intensive treatment was initiated only on the fifth day of illness. The patient went into septic shock, respiratory failure, and death. Plague was confirmed by polymerase chain reaction (PCR). This case emphasizes the importance of having a high suspicion rate for plague.

Seroprevalence and spatial distribution dynamics of Yersinia pestis antibodies in dogs and cats from plague foci in the State of Ceará, Northeastern Brazil

Abstract INTRODUCTION: In Brazil, the plague is established in several foci located mainly in the northeastern part of the country, where it alternates between active and quiescent periods. These foci in the State of Ceará have high epidemiological importance. In addition to other plague detection activities, plague areas can be monitored through serological surveys of dogs and cats (domestic carnivores), which, following feeding on plague-infected rodents, can develop mild to severe forms of the disease and produce long-lasting antibodies. This study aimed to characterize the circulation dynamics and spatial distribution of Yersinia pestis antibodies in dogs and cats in plague foci areas of Ceará. METHODS: An ecological study was conducted to analyze the temporal series and spatial distribution of secondary data obtained from domestic carnivore serum surveillance in Ceará's plague areas from 1990 to 2014. RESULTS: Joinpoint analysis revealed that the overall trend was a reduction in antibody-positive animals. The mean proportion of antibody-positivity during the whole study period was 1.5% (3,023/203,311) for dogs, and 0.7% (426/61,135) for cats, with more than 4% antibody-positivity in dogs in 1997 and 2002. Antibody titers ranging from 1/16 to 1/64 were frequent. Despite fluctuations and a significant reduction, in recent years, there were antibody-positive animals annually throughout the study period, and the localities containing antibody-positive animals increased in number. CONCLUSION: Yersinia pestis is actively circulating in the study areas, posing a danger to the human population.

Aplicação da técnica Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) no desenvolvimento de um teste para o diagnóstico da peste / Application of the technique Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in developing a test for the plague diagnosis

A peste, infecção causada pela bactéria Yersinia pestis, é uma zoonose primária de roedores, geralmente transmitida por pulgas, que infecta humanos e outros mamíferos. O diagnóstico bacteriológico tradicional da peste pode ser comprometido pela qualidade das amostras coletadas em áreas remotas, transportadas inadequadamente e recebidas no laboratório semanas após a coleta. Técnicas de diagnóstico molecular dispensam o cultivo e são exequíveis quando as bactérias estão inviáveis ou em amostras multicontaminadas. Métodos moleculares convencionais (PCR, qPCR, Nested-PCR) requerem equipamentos sofisticados para amplificação e visualização dos resultados, impedindo seu uso em laboratórios menos equipados. A amplificação isotérmica mediada por loop (Loop-mediated isothermal amplification - LAMP), uma variação da PCR convencional, utiliza enzima que permite amplificação isotérmica, apresenta alta especificidade, sensibilidade, rapidez e custo reduzido, sendo utilizada na detecção de diversos patógenos. Esta técnica emprega de quatro a seis primers e a enzima Bst DNA polimerase, que além da atividade de síntese, atua abrindo a fita dupla de DNA. O resultado da amplificação é visualizado no próprio tubo, a olho nu. O objetivo deste projeto foi aplicar a técnica LAMP no desenvolvimento de um teste para o diagnóstico da peste. Foram construídos cinco primers específicos para amplificação do gene caf1, exclusivo de Y. pestis, utilizados em ensaios com o DNA da cepa Y. pestis A1122, para determinar as concentrações ótimas dos reagentes, temperatura de incubação (60°C, 63°C e 65°C) e tempo de duração da reação (15, 30, 45, 60 e 90 minutos). As reações foram incubadas em banho maria. A amplificação foi visualizada diretamente nos tubos contendo SYBR® Safe ou SYBR® Green I. Foi observado que a partir de 45 minutos de reação ocorre amplificação do gene caf1, nas três temperaturas testadas. Além disso, a técnica mostrou-se específica e sensível, detectando até 10 pg de DNA de Y. pestis.

Contribuição para o diagnóstico de peste / Contribution towards plague diagnosis

Apesar de sua fundamentação clínico-epidemiológica, numerosos casos suspeitos de peste nos focos brasileiros têm sido descartados por serem negativos pelo teste de hemaglutinação para detecção de anticorpos contra o antígeno F1 da Yersinia pestis. A transcendência da peste justifica estudar se tais resultados decorrem da falta de resposta ao F1, e se outras proteínas da Yersinia pestis poderiam ser reconhecidas nos soros suspeitos, sendo desta forma candidatas como alvo diagnóstico alternativo ao F1. Assim sendo, cepas de Yersinia pestis e de Yersinia pseudotuberculosis, uma proteína YopH recombinante e a F1 foram utilizadas para analisar soros de pacientes e soros imunes de coelhos. A F1 e a YopH não foram reconhecidas pelos soros humanos HA- e nenhuma proteína majoritária, comum a todos os soros humanos e coelhos, foi identificada, o que permite concluir que os casos suspeitos devem ser submetidos a uma avaliação clínico-laboratorial mais rigorosa, aprofundando a investigação epidemiológica em busca de outras etiologias.

Despite the clinical-epidemiological features of plague, numerous suspected cases in Brazilian outbreaks have been discarded because of negative results from the hemagglutination test for antibodies against the Yersinia pestis F1 antigen. The transcendence of plague justifies studying whether such results are due to unresponsiveness to F1, and whether other Y. pestis proteins might be recognized in suspect serum. These would therefore be candidates to be alternative diagnostic targets to the F1 antigen. Thus, strains of Y. pestis and Y. pseudotuberculosis, a recombinant YopH protein and the F1 antigen were used to analyze serum from patients and immune serum from rabbits. F1 and YopH were not recognized by HA-negative human serum and no major protein common to all the human and rabbit serum samples was identified. This allows the conclusion that suspected cases must be subjected to more rigorous clinical-laboratory evaluation, with strengthening of epidemiological investigations in the search of other etiologies.

Avaliação da técnica Nested-PCRTbU para aplicação no diagnóstico da peste / Evaluation of Nested-PCRTbU technique for application in the diagnose of pestis

O diagnóstico de certeza da peste baseia-se na identificação e isolamento da Y. pestis pelo cultivo de material de pacientes humanos, de roedores e suas pulgas. No Brasil, os casos humanos e as epizootias de peste ocorrem em locais distantes dos centros de diagnóstico. A competição com a flora cadavérica das carcaças de roedores e procedimentos inadequados de conservação e transporte das amostras aos laboratórios pode resultar na morte do bacilo e resultados falso-negativos. As técnicas moleculares apresentam-se como alternativas para estas situações, particularmente técnicas baseadas em PCR. No presente trabalho foi otimizada para o diagnóstico da peste a técnica N-PCRTbU que se baseia na separação física dos primers por imobilização dos primers internos na tampa do microtubo, dispensando a abertura do mesmo entre as duas etapas de amplificação, o que reduz a possibilidade de falsopositivos pela contaminação cruzada durante a manipulação dos amplicons no Nested-PCR convencional. Dois pares de primers, dirigidos ao gene estrutural (caf1) do antígeno F1 de Y. pestis (um par com homologia a uma região mais externa ao alvo e outro com homologia a uma região mais interna), foram inicialmente testados individualmente por PCR e depois por N-PCR tendo sido obtidos segmentos de tamanho esperado. Foram estabelecidas as concentrações de Taq DNA polimerase, dNTPs e MgCl2, bem como a proporção entre os primers externos e internos para o N-PCRTbU. Nos ensaios para estabelecimento do limiar de detecção a partir de DNA total e da cultura da cepa Y. pestis P. PB 881 a N-PCRTbU foi capaz de detectar respectivamente 10 pg de DNA e 20 bactérias viáveis. Baços de camundongos "Swiss Webster" infectados experimentalmente com a cepa Y. pestis P. PB 881 e amostras de baço, fígado, pulmão e coração conservadas no meio de Cary-Blair por 11 meses foram analisadas em paralelo por cultivo em gelose peptonada e pela técnica NPCRTbU. O fragmento de tamanho esperado (460pb) foi amplificado em todas as amostras mesmo nas que se revelaram multicontaminadas ou negativas pela cultura. Nos ensaios com DNA de outras espécies do gênero Yersinia: Y. pseudotuberculosis e Y. enterocolitica e com baços de camundongos não infectados com a Y. pestis não houve amplificação. Além da especificidade e sensibilidade, como os resultados podem ser obtidos rapidamente, em menos de 24 horas, a N-PCRTbU poderá ser mais uma opção em situações emergenciais [...]

The use of filter paper plasticized with polyvinyl alcohol-glutaraldehyde in ELISA

F1-antigen purified from Yersinia pestis was covalently linked to 5-mm diameter filter paper discs plasticized with polyvinyl alcohol-glutaraldehyde. These discs were used both for ELISA and dot-ELISA for the detection of anti-F1 IgG in rabbits. The best conditions were achieved using 1.25 µg of F1 antigen/disc, 3 percent w/v skim milk in PBS as blocking agent, anti-IgG peroxidase conjugate diluted 12,000 times, and serum from rabbits immunized or not against Y. pestis, diluted 6,400 times. The absorbance values obtained from the comparative study between this procedure and conventional ELISA were not significantly different but the low cost of the reagents employed in ELISA using the filter paper discs plasticized with polyvinyl alcohol-glutaraldehyde makes this method economically attractive.

Cellulose acetate as solid phase in ELISA for plague

Antigen from Yersinia pestis was adsorbed on cellulose acetate discs (0.5 cm of diameter) which were obtained from dialysis membrane by using a paper punch. ELISA for human plague diagnosis was carried out employing this matrix and was capable to detect amount of 1.3 µg of antigen, 3,200 times diluted positive serum using human anti-IgG conjugate diluted 1:4,000. No relevant antigen lixiviation from the cellulose acetate was observed even after washing the discs 15 times. The discs were impregnated by the coloured products from the ELISA development allowing its use in dot-ELISA. Furthermore, cellulose acetate showed a better performance than the conventional PVC plates.

A simple PCR-based procedure for plague diagnosis

Triturados de bacos de animais infectados experimentalmente com Y. pestis, suspensos em salina foram fervidos e os sobrenadantes usados diretamente para amplificacao do PCR sem previa extracao do DNA. O limiar de deteccao pode ser aumentado por uma segunda etapa de amplificacao (Nested-PCR). Nao houve infectados usados como controle

Manual de procedimientos de laboratorio para el diagnóstico de peste / Procedure laboratory manual for plague diagnosis

Contenido: 1. Obtención y envío de la muestra; 2. Pruebas de laboratorio para el diagnóstico de Peste; 3. Inmunofluorescencia Directa (IFA); 4. Prueba de aglutinación en látex; 5. Aislamiento por cultivo de yesinia pestis; 6. Técnicas de ELISA; 7. Inoculación en ratón

Evaluation of three serological tests for the detection of human plague in northeast Brazil

The passive haemagglutination (PHA) test, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and the dot enzyme-immunosorbent assay (DOT-ELISA) were used to detect the levels of IgG antibodies against the Fraction 1 (F1) antigen of Yersinia pestis in sera of plague-infected patients from Northeast Brazil. Twenty three selected PHA-positive sera of subjects with bacteriological confirmation of plague were also positive in the DOT-ELISA but only 19 were detected by the conventional ELISA technique. Another group of 186 serum samples from subjects diagnosed as plague-infected by clinical and epidemiological parameters, but PHA-negative, were screened with DOT-ELISA and 11 gave positive results. The specificity of the assays on the serological detection of plague was confirmed in inhibition tests using purified F1 antigen. These results suggest that DOT-ELISA can be an useful, simple and more sensitive alternative for the serodiagnosis of plague in Northeast Brazil

Emprego do teste de imunofluorescência no diagnóstico da peste (infecçäo pela Yersinia Pestis) nos focos do nordeste do Brasil / Use of immunofluorescent antibody test in the plague diagnosis in the foci of the Brazil

Para avaliar a importância do emprego do teste de IMF na metodologia das atividades de vigilância e controle da peste nos focos brasileiros, foram realizados estudos com 10 macerados de "pools" de pulgas infectadas experimentalmente pela Yersinia pestis, 10 amostras de macerados de baços de roedores naturalmente infectados e 50 amostras de suco bubonático de pacientes, obtidos durante um surto de peste no Estado da Paraíba, em 1986. Os resultados das análises mostraram que o teste de IMF é inadequado para a detecçäo da Y. pestis em maceradores, entretanto apresenta interesse no diagnóstico da peste em material humano e de roedores, particularmente no caso de amostras contaminadas ou quando as bactérias tenham perdido a viabilidade

Estudos bacteriológicos e sorológicos de um surto de peste no Estado da Paraíba, Brasil / Bacteriological and serological studies of a plague outbreak in the Paraíba state, Brazil

Foram realizados estudos bacteriológicos e/ou sorológicos para diagnóstico da infecçäo pestosa, em material obtido de 452 pacientes (48 positivos), 1.938 roedores e outros pequenos mamíferos (75 positivos), 4.756 cäes (141 positivos) e 3.047 gatos (57 positivos), oriundos de 41 municípios localizados em toda a extensäo da área paraibana do Planalto da Borborema. A infecçäo foi encontrada em 21 municípios. Foram isoladas 20 cepas de Yersinia pestis de amostras coletadas de três pacientes e 17 roedores. Estas cepas apresentam características bioquímicas, fatores de virulência, sensibilidade aos antibióticos e poder patogênico experimental semelhantes ao de cepas isoladas anteriormente. Pelos estudos realizados näo foram observados, no surto de peste que eclodiu em setembro de 1986 na Paraíba, fatores diferentes dos observados nos outros focos do nordeste do Brasil

Estudo comparativo entre as técnicas de hemaglutinaçäo e aglutinaçäo bacteriana no diagnóstico da peste humana / Comparative study between hemagglutination and bacterial agglutination technics in the diagnosis of human plague

A técnica de aglutinaçäo bacteriana com 12 cepas de Yersinia pestis, foi utilizada para reexaminar 194 soros humanos negativos ao teste de hemaglutinaçäo passiva (PHA) contra a fraçäo antigênica purificada 1A da Y. pestis, empregado rotineiramente no diagnóstico da peste humana. Os soros foram obtidos de pacientes considerados suspeitos de peste por evidência clínica e epidemiológica. Nenhum dos soros negativos ao teste de hemaglutinaçäo apresentou anticorpos aglutinantes contra as cepas bacterianas testadas, enquanto que entre os soros controles positivos, obteve-se maior frequência de aglutinaçäo naqueles com títulos hemaglutinantes mais elevados. Sendo menos sensível, a técnica de aglutinaçäo bacteriana näo ofereceu vantagem sobre a hemaglutinaçäo

Detecçäo da peste no Estado da Bahia, Brasil / Plague detection in the Bahia State, Brazil

Demonstra-se a atividade da Yersinia pestis, bacteriológica e sorologicamente, nos focos pestosos da Bahia. Inquéritos sorológicos, nos canídeos domésticos, ajudam na detecçäo da peste dos roedores