[Obtention of a heterohybridoma for production of type IgM monoclonal antibodies against the D antigen of the Rh system]. / Obtención de heterohibridoma productor de anticuerpos monoclonales de tipo IgM contra el antígeno D del sistema Rh.

The objective was to obtain a heterohybridoma capable of producing a monoclonal antibody with IgM type anti-D specificity (Rh system), that could be used as a reactive for hemoclasification. Mononuclear cells (MNC) were extracted from a blood sample of a highly sensitized woman, five days after giving birth to an Rh positive child. These were then transformed with the culture supernatant (CSN) of B05.8 cells, rich in Epstein Barr virus (EBV). Once transformed and in exponential growth, they were fused with K6H6/B5 line cells using PEG 4.000 as a fusing agent in a 1:1 proportion. After fusion, they were seeded in culture plates in order to evaluate the formation of hybrids and the secretion of specific antibodies in the CSN of each well. The efficiency of the fusion was 1.8 x 10(-6), making it possible to obtain an anti-D IgM producing clone, which we named BMS-9. This clone could be maintained in constant culture for three months, producing antibodies in a concentration of 4 microg/mL in de CSN. It was also possible to obtain antibodies with an Artificial Capilar System (ACS) reaching a concentration of 24 microg/mL. Potency was determined using Ror cells. In CSN at immediate centrifugation (IC): 1 x 32, score 52; 15' from incubation at room temperature (RT): 1 x 1,024 score 105. With that ACS product at IC: 1 x 32 score 54; 15' from incubation at RT: 1 x 8.192 score 136; and a 37 degrees C: 1 x 8,192 score 136. Reactivity was detected with red cells D(IIIa), D(IV), D(Va), D(VI) type IV, D(VII), DFR, DNU, STEM+, DAR and DAU. There was no reactivity with red cells D(IIIc), DI(Va), D(V) type II, D(VI) types I, II y III, Ro(HAR), DOL and weak D type II. During field study, no false negative or false positive reactions were detected. A stable heterohybridoma was obtained, producer of IgM type anti-D, with enough qualities to be used in blood typing. Given the excellent qualities of the antibody, we are evaluating dilution media and the addition of type IgG antibodies in order to manufacture a reactive for use in hemoclassification.

Obtención de heterohibridoma productor de anticuerpos monoclonales de tipo IgM contra el antígeno D del sistema Rh / Obtention of a heterohybridoma for production of type IgM monoclonal antibodies against the D antigen of the Rh system

El objetivo de este trabajo fue obtener un heterohibridoma capaz de producir anticuerpo monoclonal con especificidad anti-D (Sistema Rh) de tipo IgM, que pueda ser utilizado como reactivo en la hemoclasificación. Las células mononucleares (CMN) se extrajeron de una muestra de sangre de mujer altamente sensibilizada, al 5to día del post parto de RN Rh positivo. Fueron sometidas a proceso de transformación con sobrenadante de cultivo (SNC) de células B95.8 rico en viriones de Epstein Barr (VEB). Una vez transformadas y en crecimiento exponencial se fusionaron con células de la línea K6H6/B5, utilizando como agente fusógeno el PEG 4.000 en una proporción 1:1. Luego de la fusión se sembraron en placas de cultivo para posteriormente evaluar en los SNC de cada pozo, la formación de h¡bridos y la secreción de anticuerpos específicos. La eficiencia de fusión fue de 1,8 x 10-6, lográndose obtener una clona productora de anti-D IgM a la que denominamos BMS-9, la cual se pudo mantener en cultivo continuo por 3 meses produciendo anticuerpos a una concentración de 4 µg/mL en sobrenadante de cultivo (SNC). También se logró obtener anticuerpos en Sistema Capilar Artificial (SCA) alcanzando una concentración de 24 µg/mL. La potencia se determinó utilizando células Ror: En SNC a centrifugación inmediata (CI): 1 x 32, score 52; a 15` de incubación a TA: 1 x 1024 score 105; y a 37ºC: 1 x 1024 score 105. Con el producto del SCA, a CI: 1 x 32 score 54; a 15`de incubación a TA: 1 x 8192 score 136; y a 37ºC: 1 x 8192 score 136. Se detectó reactividad con eritrocitos DIIIa, DIV, DVa, DVI tipo IV, DVII, DFR, DNU, STEM+, DAR y DAU. No hubo reactividad con eritrocitos DIIIc, DIVa, DV tipo II, DVI tipo I, II y III, RoHAR, DOL y D débil tipo II. En estudio de campo, no se detectaron reacciones falsas negativas ni falsas positivas. Se obtuvo un heterohibridoma estable, productor de anti-D de tipo IgM, con cualidades suficientes para ser utilizado en la tipificación sanguínea.