RESUMO
The DEK oncoprotein regulates cellular chromatin function via a number of protein-protein interactions. However, the biological relevance of its unique pseudo-SAP/SAP-box domain, which transmits DNA modulating activities in vitro, remains largely speculative. As hypothesis-driven mutations failed to yield DNA-binding null (DBN) mutants, we combined random mutagenesis with the Bacterial Growth Inhibition Screen (BGIS) to overcome this bottleneck. Re-expression of a DEK-DBN mutant in newly established human DEK knockout cells failed to reduce the increase in nuclear size as compared to wild type, indicating roles for DEK-DNA interactions in cellular chromatin organization. Our results extend the functional roles of DEK in metazoan chromatin and highlight the predictive ability of recombinant protein toxicity in E. coli for unbiased studies of eukaryotic DNA modulating protein domains.
Assuntos
Cromatina/metabolismo , Proteínas Cromossômicas não Histona/genética , Proteínas Cromossômicas não Histona/metabolismo , DNA/metabolismo , Escherichia coli/efeitos dos fármacos , Mutação com Perda de Função , Proteínas Oncogênicas/genética , Proteínas Oncogênicas/metabolismo , Proteínas de Ligação a Poli-ADP-Ribose/genética , Proteínas de Ligação a Poli-ADP-Ribose/metabolismo , Proteínas Recombinantes/toxicidade , Viés , Núcleo Celular/efeitos dos fármacos , Tamanho Celular/efeitos dos fármacos , Cromatina/química , Cromatina/genética , Proteínas Cromossômicas não Histona/química , Proteínas Cromossômicas não Histona/toxicidade , Escherichia coli/genética , Escherichia coli/crescimento & desenvolvimento , Regulação Bacteriana da Expressão Gênica/efeitos dos fármacos , Genoma Bacteriano/efeitos dos fármacos , Genoma Bacteriano/genética , Humanos , Mutagênese , Nucleossomos/química , Nucleossomos/genética , Nucleossomos/metabolismo , Proteínas Oncogênicas/química , Proteínas Oncogênicas/toxicidade , Fragmentos de Peptídeos/química , Fragmentos de Peptídeos/genética , Fragmentos de Peptídeos/metabolismo , Fragmentos de Peptídeos/toxicidade , Proteínas de Ligação a Poli-ADP-Ribose/química , Proteínas de Ligação a Poli-ADP-Ribose/toxicidade , Domínios Proteicos/genética , Proteínas Recombinantes/química , Proteínas Recombinantes/genética , Proteínas Recombinantes/metabolismo , Testes de Toxicidade/métodosRESUMO
In two proof-of-concept studies, we established and validated the Bacterial Growth Inhibition Screen (BGIS), which explores recombinant protein toxicity in Escherichia coli as a largely overlooked and alternative means for basic characterization of functional eukaryotic protein domains. By applying BGIS, we identified an unrecognized RNA-interacting domain in the DEK oncoprotein (this study) and successfully combined BGIS with random mutagenesis as a screening tool for loss-of-function mutants of the DNA modulating domain of DEK [1]. Collectively, our findings shed new light on the phenomenon of recombinant protein toxicity in E. coli. Given the easy and rapid implementation and wide applicability, BGIS will extend the repertoire of basic methods for the identification, analysis and unbiased manipulation of proteins.
Assuntos
Escherichia coli/efeitos dos fármacos , Escherichia coli/crescimento & desenvolvimento , Proteínas Recombinantes de Fusão/metabolismo , Proteínas Recombinantes de Fusão/toxicidade , Testes de Toxicidade/métodos , Animais , Viés , Biocatálise , Proteínas Cromossômicas não Histona/química , Proteínas Cromossômicas não Histona/genética , Proteínas Cromossômicas não Histona/metabolismo , Proteínas Cromossômicas não Histona/toxicidade , Proteínas de Drosophila/química , Proteínas de Drosophila/genética , Proteínas de Drosophila/metabolismo , Proteínas de Drosophila/toxicidade , Escherichia coli/genética , Humanos , Mutação com Perda de Função , Proteínas Oncogênicas/química , Proteínas Oncogênicas/genética , Proteínas Oncogênicas/metabolismo , Proteínas Oncogênicas/toxicidade , Fragmentos de Peptídeos/química , Fragmentos de Peptídeos/genética , Fragmentos de Peptídeos/metabolismo , Fragmentos de Peptídeos/toxicidade , Proteínas de Ligação a Poli-ADP-Ribose/química , Proteínas de Ligação a Poli-ADP-Ribose/genética , Proteínas de Ligação a Poli-ADP-Ribose/metabolismo , Proteínas de Ligação a Poli-ADP-Ribose/toxicidade , Domínios Proteicos/genética , RNA/metabolismo , Proteínas de Ligação a RNA/química , Proteínas de Ligação a RNA/genética , Proteínas de Ligação a RNA/metabolismo , Proteínas de Ligação a RNA/toxicidade , Receptores da Família Eph/química , Receptores da Família Eph/genética , Receptores da Família Eph/metabolismo , Receptores da Família Eph/toxicidade , Proteínas Recombinantes de Fusão/química , Proteínas Recombinantes de Fusão/genética , Reprodutibilidade dos Testes , Fatores de Tempo , Testes de Toxicidade/normasRESUMO
The mechanism of the cytotoxicity by natural killer (NK) cells is not known. It is speculated that there exist several positively regulated and negatively regulated target molecules expressed on the target cell surface. Although one of the latter is considered to be major histocompatibility complex antigen (MHC) class I, in this study we described a novel non-MHC class I molecule that may negatively regulate the NK cytotoxicity. This antigen is defined by monoclonal antibody Cho-1 and is composed of noncovalently associated antigens that are 40 and 200 kilodaltons in molecular size. The expression of this antigen is reduced along with the cell growth induced by growth factors and/or oncogenes. Thus, Cho-1-defined antigen appears to be involved as one of the resistant molecules in the cytotoxic mechanism of NK cells.
Assuntos
Fibroblastos/citologia , Genes MHC Classe I/imunologia , Células Matadoras Naturais/imunologia , Proteínas Associadas aos Microtúbulos/imunologia , Animais , Anticorpos Monoclonais/imunologia , Complexo Antígeno-Anticorpo/genética , Complexo Antígeno-Anticorpo/imunologia , Divisão Celular/efeitos dos fármacos , Divisão Celular/imunologia , Eletroforese em Gel de Poliacrilamida , Fibroblastos/imunologia , Citometria de Fluxo , Regulação da Expressão Gênica/genética , Regulação da Expressão Gênica/imunologia , Substâncias de Crescimento/toxicidade , Células Matadoras Naturais/citologia , Proteínas Associadas aos Microtúbulos/genética , Peso Molecular , Proteínas Oncogênicas/toxicidade , RatosRESUMO
Transformation of NIH3T3 cells with the ras, the sis, or the neu oncogene rendered cells less susceptible to cis-diamminedichloroplatinum(II). Since resistance to cis-diamminedichloroplatinum(II) is reported to be associated with increased levels of metallothionein, we examined effects of these oncogenes on metallothionein gene expression. NIH3T3 cells were first transfected with the lacZ gene whose transcription is under the control of mouse metallothionein I promoter and then with the ras, the sis, or the neu oncogene. The ras and the sis oncogenes increased beta-galactosidase activities which were induced either by metal (cadmium and zinc) or by glucocorticoid (dexamethasone), whereas the neu oncogene repressed its activity. When SV40 early promoter was used instead of metallothionein I promoter for the lacZ gene transcription, the beta-galactosidase activities were not affected by metal, dexamethasone, or any of these oncogenes. This result was coincident with that of reverse transcription polymerase chain reaction that metal-induced MT I mRNA was only detected in the sis- or the ras-transformed cells, whereas any of these oncogenes did not affect the metal-induced transcription of the MT II gene. These results demonstrate that the ras and the sis oncogenes upregulate the metal- or glucocorticoid-induced transcription from metallothionein I promoter, but the neu oncogene negatively regulates it. Thus, resistance to the chemotherapeutic agent by oncogenic transformation is partly associated with the metallothionein gene expression, and MT I and MT II gene expressions are differently controlled by different oncogenes.