Caracterização da expressão e função da trombospondina 2 no câncer de próstata / [Characterization of the expression and function of thrombospondin 2 in cancer of prostate]

RESUMO

A trombospondina 2 (TSP2) é uma glicoproteína secretada na matriz extracelular envolvida com inibição de crescimento e angiogênese tumorais. Sua expressão em tumores é bastante controversa, dependendo do tipo tumoral. A caracterização do nível de expressão e da função de TSP2 ainda não foi realizada no câncer de próstata (CaP). Os objetivos deste trabalho são caracterizar o perfil de expressão de TSP2 no CaP e sua potencial aplicação no diagnóstico diferencial entre CaP e hiperplasia prostática benigna (HPB), além de investigar sua função no CaP. Para tanto, o nível de expressão do transcrito TSP2 foi analisado por PCR quantitativo em tempo real, em amostras teciduais de CaP e HPB e em linhagens prostáticas tumorais e não tumorais. A expressão da proteína TSP2 foi avaliada por imunohistoquímica em microarranjo de tecidos contendo amostras de CaP e HPB e utilizando um sistema semi-automático de análise de imagem celular. Linhagens celulares de CaP (PC3 e DU145) foram tratadas com a proteína recombinante de TSP2 (recTSP2) (50 µg/mL), sendo realizadas análises de viabilidade e de ciclo celular, além de análise fosfo-proteômica na linhagem PC3 tratada com recTSP2, através de um arranjo contendo anticorpos para 46 proteínas fosforiladas. Observamos que o transcrito TSP2 apresentou menores níveis de expressão em amostras teciduais e linhagens de CaP, em comparação com amostras teciduais de HPB e linhagem não tumoral prostática (p<0,01). Em análise de curva ROC (Receiving Operating Curve), o transcrito TSP2 mostrou-se mais eficiente na distinção entre CaP e HPB (p<0,01) do que os níveis séricos de PSA (p=0,299). A expressão da proteína TSP2 foi observada no citoplasma das células dos compartimentos estromais e epiteliais de CaP e HPB. Notadamente, o escore da marcação estromal de TSP2 nos tecidos de CaP apresentou-se significativamente menor do que em HPB (p<0,01), enquanto o padrão de marcação epitelial mostrou- se similar entre as duas doenças. O tratamento das linhagens PC3 e DU145 com recTSP2 diminuiu a viabilidade destas células, além de aumentar o percentual de células na fase sub-G1 do ciclo celular. A análise fosfo-proteômica das células PC3 tratadas mostrou que resíduos das proteínas ERK1/2 e JNK apresentam menor nível de fosforilação, enquanto que resíduos das proteínas Akt, p70S6, p53, paxilina, RSK1/2/3 e p27 possuíam maior nível de fosforilação. Em conjunto, estes dados demonstram que TSP2 apresenta menor expressão no CaP, especialmente no compartimento estromal. Os níveis alterados de TSP2 apresentam potencial aplicação no diagnóstico diferencial de CaP e HPB. Adicionalmente, os resultados gerados por este estudo fazem a primeira descrição da potencial função de TSP2 no CaP, reforçando a possibilidade de TSP2 ser um inibidor tumoral em células de CaP, o que já foi demonstrado para outros tipos tumorais (AU)

ABSTRACT

Thrombospondin 2 (TSP2) is a glycoprotein that is secreted in the extracellular matrix and is related to tumor growth and angiogenesis inhibition. However, its expression in tumors is quite controversial, depending on the tumor type. Despite the characterization of TSP2 expression level and function has been shown for some tumors types, a detailed characterization in prostate cancer (PCa) has not been performed. This study aims to characterize TSP2 expression profile in PCa and its potential application in the differential diagnosis between PCa and benign prostatic hyperplasia (BPH), and to characterize TSP2 possible functions in PCa. TSP2 transcript expression levels were analyzed by real-time quantitative PCR in PCa and BPH tissue samples and tumor and non tumor prostate cell lines. Protein expression was evaluated in tissue microarray assay containing PCa and BPH tissue samples, by immunohistochemistry with an anti-TSP2 antibody, and using a semi- automated image analysis system. To investigate the functional role of TSP2 in PCa, PCa cell lines (DU145 and PC3) were treated with TSP2 recombinant protein (recTSP2) (50 µg/mL). Cell viability and cell cycle analysis were performed. There was also performed phospho-proteomic analysis in PC3 cells treated with recTSP2 through an array containing antibodies to 46 phosphorylated proteins. Our results showed that TSP2 transcript expression was down regulated in PCa tissue samples and cell lines, as compared to BPH tissue samples and non-tumor prostate cell line (p <0.01). ROC (Receiving Operating Curve) analyses showed that TSP2 transcript expression level was more efficient in distinguishing between PCa and BPH groups (p <0.01) than serum PSA (p = 0.299). TSP2 protein expression was observed in the cytoplasm of cells of epithelial and stromal compartments of PCa and BPH. Notably, TSP2 stromal staining score was significantly lower in PCa than in BPH (p <0.01), whereas the epithelial staining pattern was found to be similar for both diseases. PC3 and DU145 cell lines treatment with recTSP2 significantly reduced viability of these cells, and increase the percentage of cells in sub-G1 phase of the cell cycle. The phospho- proteomic analysis of treated PC3 cells showed that the proteins ERK1/2 and JNK presented lower phosphorylation level. However, Akt, p70S6, p53, p27, paxillin and RSK1/2/3 had a higher level of phosphorylation after treatment with recTSP2. Together, these data demonstrate that TSP2 is down regulated in PCa, especially in the stromal compartment. TSP2 diminished levels in PCa have potential application in the differential diagnosis of PCa and BPH. Additionally, the results generated in this study are the first description of the potential role of TSP2 in PCa, reinforcing the possibility that TSP2 is an inhibitor of PCa, which has been demonstrated for other tumor types. (AU)