Caracterização funcional das isoformas variantes de 'splicing' da osteopontina nos carcinomas de ovário e próstata / Functional characterization of osteopontin 'splicing' variant isoforms in ovarian and prostate carcinomas

RESUMO

"A osteopontina (OPN) é um dos transcritos que apresenta maiores aumentos no nível de expressão no câncer de ovário (CO) e próstata (CaP), e está envolvida na tumorigênese e metástase. O gene que codifica a OPN está sujeito à 'splicing' alternativo, gerando 3 mensagens, denominadas de OPNa, OPNb e OPNc. O objetivo deste projeto é a caracterização do perfil de expressão e do papel funcional das isoformas variantes de 'splicing' da OPN na tumorigênese e progressão tumoral no CO e CaP. A OPNc encontra-se especificamente expressa nos tumores malignos de ovário. No CaP, observamos que as isoformas apresentam maior nível de expressão na amostras de CaP quando comparado com o tumor benigno da próstata. A expressão diferencial das isoformas da OPN nas amostras tumorais e não tumorais de ovário e próstata identificam as isoformas como potenciais novos biomarcadores para estas neoplasias. Observamos que a OPNc, no modelo de ovário e próstata, e a OPNb, no modelo de próstata, apresentam efeitos estimulatórios sobre a proliferação, migração, invasão, formação de colônia e crescimento de tumores in vivo. A OPNc nos dois modelos tumorais estimula a proliferação celular da IOSE e RWPE-1, indicando que a OPNc apresenta características pró-tumorigênicas. Descrevemos também que os efeitos da OPNb e OPNc são mediados pela via de sinalização PI3K/Akt. Com base na observação de que tumores que superexpressam a OPNc apresentam altos níveis de expressão de marcadores típicos de angiogênese nos tumores ovarianos, tais como VEGF-A, Flk-1 e CD34, investigamos o papel funcional e o mecanismo molecular pelo qual a OPNc estimula a angiogênese no CO. Nossos dados demonstram que a OPNc secretada interage com receptores do tipo integrinas de forma RGD-dependente, possivelmente ativando a via de sinalização PI3K/Akt. Observamos também que a OPNc secretada e a via de sinalização PI3k/Akt modulam a expressão de VEGF-A, c-Fos e c-Jun e a fosforilação de c-Jun. Adicionalmente, observamos que o meio condicionado da OPNc induz a proliferação, migração e adesão das células endoteliais HUVEC, de forma a contribuir para a neovascularização. Através de PCR em tempo real, caracterizamos que a OPNc altera a expressão de 34 genes, no modelo de CO, e 16 genes, no CaP, essenciais para a transformação e progressão tumoral destas neoplasias. Os resultados gerados por este estudo contribuem para o melhor entendimento da biologia e dos mecanismos moleculares do CO e CaP. O papel crucial destas isoformas em distintas etapas da progressão destes tumores indicam a OPNb e OPNc como potenciais alvos terapêuticos para o CO e CaP"(AU)

ABSTRACT

"Osteopontin (OPN) is one of the proteins overexpressed in ovarian carcinoma (OC) and prostate cancer (PCa), and is involved in tumorigenesis and metastasis. Alternative splicing of OPN (OPN-SI) leads to 3 isoforms, OPNa, OPNb, and OPNc. This study aims to characterize the expression profile and functional roles of OPN isoforms in OC and PCa tumor progression. In OC, OPNc is specifically expressed in ovarian tumor samples. PCa tissue samples presented significantly higher levels of OPN-SI transcripts than in BPH specimens. OPN-SI mRNA expression were positively correlated with Gleason Score. The OPNc isoform was the most upregulated variant and the best marker to distinguish patients groups, presenting sensitivity and specificity of 90% and 100%, respectively. OPNc, in OC and PCa, and OPNb, in PCa, significantly activated OvCar-3 and PC-3 cell proliferation, migration, invasion, anchorage independent growth and tumor formation in vivo. Additionally, we have also shown that some of the OPNc-dependent protumorigenic roles are mediated by PI3K/Akt signaling pathway. OPNc stimulated immortalized ovarian and prostate epithelial cell proliferation, indicating a role for this isoform in OC and PCa tumorigenesis. Functional assays using OPNc conditioned medium and an anti-OPNc antibody have shown that most cellular effects observed here were promoted by the secreted OPNc. We identified that OPNc can affect the expression of genes involved in cancer pathways in these tumor models. Tumors formed by OvCar-3 OPNc-overexpressing cells present high expression levels of typical angiogenesis markers, as VEGF-A, VEGFR-2 and CD34. Based on this observation, we also investigated the molecular mechanisms by which OPNc stimulates angiogenic processes. Our data showed that OPNc overexpression activates VEGF-A expression and secretion, also through the PI3K/Akt pathway. This splicing isoform is also able to activate the expression of c-Fos, c-Jun and phospho-c-Jun. OPNc role on activating the phosphorylation of c-Jun is mediated by integrin receptor, in an RGD dependent manner. OPNc-conditioned medium is able to induce HUVEC endothelial cells proliferation, migration and adhesion. According to our data, contributes to the physiopathology of ovarian and prostate cancer progression and tumorigenesis. Altogether, the data open possibilities of new therapeutic approaches that selectively down regulate OPNc, altering its properties favoring OC and PCa tumor progression"(AU)