Imaging of Existing and Newly Translated Proteins Elucidates Mechanisms of Sarcomere Turnover.

BACKGROUND: How the sarcomeric complex is continuously turned over in long-living cardiomyocytes is unclear. According to the prevailing model of sarcomere maintenance, sarcomeres are maintained by cytoplasmic soluble protein pools with free recycling between pools and sarcomeres. METHODS: We imaged and quantified the turnover of expressed and endogenous sarcomeric proteins, including the giant protein titin, in cardiomyocytes in culture and in vivo, at the single cell and at the single sarcomere level using pulse-chase labeling of Halo-tagged proteins with covalent ligands. RESULTS: We disprove the prevailing protein pool model and instead show an ordered mechanism in which only newly translated proteins enter the sarcomeric complex while older ones are removed and degraded. We also show that degradation is independent of protein age and that proteolytic extraction is a rate-limiting step in the turnover. We show that replacement of sarcomeric proteins occurs at a similar rate within cells and across the heart and is slower in adult cells. CONCLUSIONS: Our findings establish a unidirectional replacement model for cardiac sarcomeres subunit replacement and identify their turnover principles.

Cytokines released from human adipose tissue-derived stem cells by bFGF stimulation: Effects of IL-8 and CXCL-1 on wound healing.

Objectives: Adipose-derived stem cells (ADSCs) are widely used in wound care because they release a variety of cytokines. However, the molecular mechanism of paracrine action remains unclear. It has been reported that basic fibroblast growth factor (bFGF) enhances the therapeutic potential of ADSCs. In this study, we searched for cytokines whose release from ADSCs is enhanced by bFGF stimulation. Results: Quantitative RT-PCR and ELISA analyses revealed that bFGF upregulates CXCL-1 and IL-8 mRNA synthesis and secretion from ADSCs. Both cytokines showed the ability to promote important processes for wound healing, including tube formation of vascular and lymphatic endothelial cells and cell migration of fibroblasts in vitro. Conclusions: These results suggest that bFGF stimulation increases the secretion of CXCL-1 and IL-8 from ADSCs and that these cytokines may promote angiogenesis, lymphangiogenesis, and cell migration, leading to enhanced efficiency of wound healing.

Evaluation of the Genotoxicity of Endodontic Materials for Deciduous Teeth Using the Comet Assay

ABSTRACT Objective: To evaluate genotoxicity of zinc oxide, P. A. calcium hydroxide, mineral trioxide aggregate and an iodoform paste using comet assay on human lymphocytes. Material and Methods: Two positive controls were used: methyl-methanesulfonate for the P.A. calcium hydroxide and mineral trioxide aggregate; and doxorubicin for the iodoform paste and zinc oxide. There were also two negative controls: distilled water for the P.A. calcium hydroxide and mineral trioxide aggregate; and DMSO for the iodoform paste and zinc oxide. Comets were identified using fluorescence microscopy and 100 of them were counted on each of the three slides analyzed per drug test. A damage index was established, taking into consideration the score pattern that had previously been determined from the size and intensity of the comet tail. Analysis of variance, followed by Tukey's test, was used to compare the means of the DNA damage indices. Results: The DNA damage index observed for mineral trioxide aggregate (7.08 to 8.58) and P.A. calcium hydroxide (6.50 to 8.33), which were similar to negative control index. On the other hand, damage index for zinc oxide (104.7 to 218.50) and iodoform paste (115.7 to 210.7) were similar to positive control index. Conclusion: Iodoform paste and zinc oxide showed genotoxicity at all concentrations used.

Effect of low power laser in biomodulation of cultured osteoblastic cells of Wistar rats

Abstract Purpose: To analyze aspects of the biomodulating effect of light in biological tissues, bone cells from surgical explants of the femur of rats were irradiated with low intensity laser. Methods: Bone cells were cultured and irradiated with LASER light (GaAlAs). Growth, cell viability, mineralized matrix formation, total protein dosage, immunostimulatory properties, cytochemical analysis, gene expression of bone proteins were examined using live cell imaging and cell counting by colorimetric assay. The gene expression of: alkaline phosphatase (ALP), type 1 collagen, osteocalcin and osteopontin through the real-time polymerase chain reaction. Results: At 8 days, the viability of the irradiated culture was 82.3% and 72.4% in non-irradiated cells. At 18 days, the cellular viability (with laser) was 77.42% and 47.62% without laser. At 8 days, the total protein concentration was 21.622 mg / mol in the irradiated group and 16, 604 mg / mol in the non-irradiated group and at 18 days the concentration was 37.25 mg / mol in the irradiated group and 24, 95 mg / mol in the non-irradiated group. Conclusion: The laser interfered in the histochemical reaction, cell viability, matrix mineralization, and maintained the cellular expression of proteins

Efeitos do Reiki sobre a viabilidade celular e a atividade da mieloperoxidase de neutrófilos humanos in vitro: estudo experimental / Effects of Reiki on cell viability and myeloperoxidase activity of human neutrophils in vitro: experimental study

Introdução: O Reiki está entre as terapias baseadas em energia mais frequentes. Estudar terapias com bases em mecanismos holísticos complexos e dinâmicos, influenciados por diferentes fatores individuais e ambientais exige uma série de avaliações em diferentes modelos experimentais. Neste contexto, o estudo in vitro permite o controle dos fatores externos às células, evita a alta variabilidade individual, propiciando resultados em menor tempo. Dentre os leucocitos, os neutrófilos são aqueles que estão presentes em maior quantidade no sangue periférico, atuando de maneira importante nas fases iniciais das reações inflamatórias, como mecanismo de defesa, estando no rol das primeiras células do sistema imune que se deslocam dos vasos para os tecidos. Objetivo: Avaliar o efeito do Reiki sobre a viabilidade celular e a atividade da enzima mieloperoxidase de neutrófilos humanos in vitro. Método: É um estudo laboratorial, experimental, duplo cego, com abordagem quantitativa. Foi realizado no Laboratório de Fisiologia Celular e Biologia Molecular da Universidade Cruzeiro do Sul - Campus Anália Franco - São Paulo - SP. A amostra de sangue humano foi obtida de cinco voluntários saudáveis. O ensaio necessitou de 20mL de sangue obtido por punção venosa periférica. Critério de inclusão: adulto, do sexo masculino, saudável na faixa dos 20 aos 40 anos. Critérios de exclusão: problema de saúde referido, uso de medicamentos, uso de terapia complementar (como terapias energéticas, fitoterapia, meditação e outras). O grupo experimental recebeu aplicação de Reiki, em temperatura ambiente, por meio da imposição de mãos, a 15 cm de distância por 15 minutos. A aplicação de Reiki foi realizada uma vez ao dia, durante três dias consecutivos, em sessões a cada 24 horas. O grupo controle permaneceu pelo mesmo tempo e nas mesmas condições ambientais do grupo de intervenção, sem a aplicação da técnica de biocampo. As células foram avaliadas pela técnica de exclusão do corante azul de Tripan, que permite diferenciar células vivas e mortas, pela exclusão do corante pelas células viáveis, e contadas em câmara de Neubauer. A atividade da enzima mieloperoxidase (MPO) foi avaliada por meio do ensaio de quimiluminescência. A análise da viabilidade celular foi feita em triplicata utilizando-se como resultado a média. Análise de dados. Medidas de variabilidade e tendência central, modelo de equações de estimação generalizadas para distribuição binomial nos dados de viabilidade para comparar os grupos longitudinalmente e um modelo de ANOVA para medidas repetidas não paramétrico para o MPO, ao nivel de significância de 5%. Resultados: As médias da viabilidade celular foram superiores no grupo experimental, quando observadas a média dos cinco ensaios para cada momento de aferição segundo o grupo estudado, com diferença estatisticamente significante (p = 0,0040). A atividade da MPO, expressa em Unidades Relativas de Luminescência foi superior no grupo experimental (p = 0,0020). Conclusão: Houve aumento tanto da viabilidade celular, quanto da atividade da enzima mieloperoxidase dos neutrófilos in vitro pertencentes ao grupo experimental quando comparados ao grupo controle.

Introduction: Reiki is within as more frequent energy-based therapies. Studying therapies based on complex and dynamic holistic mechanisms, influenced by different individuals and environmental factors, requires a series of assessments in different experimental models. In this context, in vitro studies allow the control of cells external factors, avoiding the high individual variability, providing results in a shorter time. Among leukocytes, neutrophils are those present in greater amounts in the peripheral blood, acting in the main role in the early stages of inflammatory reactions, as a defense mechanism, being in the rank of the first cells of the immune system that move from the vessels to the tissues. Objective: Evaluate the effect of Reiki on cell viability and myeloperoxidase activity of human neutrophils in vitro. Method: It is an experimental, double-blind, laboratory study with a quantitative approach. It was done at Laboratory of Cellular Physiology and Molecular Biology of Cruzeiro do Sul University - Anália Franco Campus - São Paulo - SP. The human blood samples were obtained from five healthy volunteers. The test required 20mL of blood obtained by peripheral venous puncture. Inclusion criteria: adult, male, between the ages of 20 and 40 years. Exclusion criteria: volunteers reporting health problems, use of medications and use of complementary therapy (as energy therapies, phytotherapy, meditation and others). The experimental group received the Reiki application, at room temperature, by means of the laying on of hands to 15 cm of distance by 15 minutes. A Reiki application was performed once a day, for three consecutive days, in sessions every 24 hours. The control group remained at the same period and at the same environmental conditions as the intervention group, but without any application of the biofield technique. The cells were evaluated through the technique of the Trypan blue exclusion test, that allows to differentiate alive and dead cells, through dye exclusion by viable cells, and counted in Neubauer's chamber. The activity of the myeloperoxidase (MPO) enzyme was evaluated by chemiluminescence assay. The analysis of cell viability was done in triplicate using as the result the measures average. Data analysis. Measurements of variability and central tendency, generalized estimation equation model equations for binomial distribution of cell viability data for a longitudinal comparison of groups and ANOVA model for non-parametric repeated measures for MPO, at a significance level of 5%. Results: The cellular viability means were higher in the experimental group when evaluated the mean of the five experimental assays in each measurement moment according to the group studied. with a statistically significant difference (p = 0.0040). MPO activity, expressed in Relative Luminescence Units, was higher in the experimental group, except in the fifth assay, and with an exacerbation of enzyme activity in the third assay, with a statistically significant difference (p = 0.0020). Conclusion: There was an increase in both cell viability and myeloperoxidase enzyme in vitro neutrophils from experimental group when compared to the control group, both with statistically significant differences.

Construção de substituto da pele composto por matriz de colágeno porcino povoada por fibroblastos dérmicos e queratinócitos humanos: avaliação histológica / Construction of a skin substitute composed of porcine collagen matrix populated with human dermal fibroblasts and keratinocytes: histological evaluation", "_e": "n

INTRODUÇÃO: O uso de enxertos autólogos é limitado pela extensão da área doadora e pelo estado clínico dos pacientes, no caso de lesões extensas. Alotransplantes coletados de cadáveres ou voluntários são rejeitados após uma ou duas semanas, servindo apenas como cobertura temporária para essas lesões. O tratamento de grandes lesões cutâneas com tegumento autólogo reconstruído constitui alternativa atraente, já que, a partir de um pequeno fragmento de pele do paciente, pode-se obter culturas de células que se multiplicam rapidamente e podem ser criopreservadas, permitindo, assim, sua utilização em novos tratamentos por tempo indeterminado. Este estudo pretendeu avaliar o comportamento histológico de queratinócitos e fibroblastos humanos cultivados sobre uma matriz de colágeno porcino derivada da submucosa intestinal. MÉTODO: Células da epiderme e derme humana foram cultivadas separadamente e semeadas sobre matriz de colágeno porcino, onde permaneceram em ambiente controlado por 21 dias, antes de serem submetidas a análise histológica. RESULTADOS: Observou-se que os fibroblastos invadem e colonizam a matriz de colágeno, enquanto os queratinócitos se organizam de forma laminar e estratificada sobre a superfície em que foram semeados. CONCLUSÕES: A utilização da matriz de colágeno porcino como carreador de células da pele humana é possível e a organização dessas células se assemelha à arquitetura da pele humana.

BACKGROUND: In the case of extensive lesions, the use of autologous grafts is limited by the extent of the donor area and the clinical condition of patients. Allografts collected from cadavers or volunteers are usually rejected after 1 to 2 weeks, thus serving only as temporary cover for these lesions. Treating major cutaneous lesions with reconstructed autologous skin is an attractive alternative, because it is possible to obtain cultures of cells that multiply rapidly and can be cryopreserved from a small fragment of the patient's skin, thereby facilitating its indefinite use in new treatments. This study evaluated the histological behavior of cultured human keratinocytes and fibroblasts on a collagen matrix derived from porcine small intestinal submucosa. METHODS: Cells from human epidermis and dermis were grown separately and seeded on porcine collagen matrix, which was maintained in a controlled environment for 21 days before being subjected to histological analysis. RESULTS: Fibroblasts invaded and colonized the collagen matrix, whereas keratinocytes were organized in laminated and stratified layers on the surface on which they were seeded. CONCLUSIONS: The use of porcine collagen matrix as a support for human skin cells is feasible, and the organization of these cells resembles the architecture of human skin.

Substitutos cutâneos: conceitos atuais e proposta de classificação / Skin substitutes: current concepts and a new classification system

Feridas complexas podem resultar na perda completa do revestimento cutâneo. A solução consagrada pela cirurgia plástica é a enxertia de pele autógena, porém há casos em que ocorre escassez de área doadora cutânea, um problema ainda não totalmente solucionado. Assim, atualmente há muito interesse por materiais sintéticos ou biológicos que possam ser utilizados como substitutos cutâneos. O objetivo deste estudo foi introduzir uma forma mais didática de agrupar diferentes tipos de substitutos cutâneos. Acreditamos que esses produtos podem ser classificados de forma mais abrangente se forem divididos segundo três critérios: camada substituída da pele, subdivididos em epidérmicos (E), dérmicos (D) e compostos dermoepidérmicos (C); duração no leito da ferida, subdivididos em temporários (T) e permanentes (P); e origem do material constituinte, subdivididos em biológicos (b), biossintéticos (bs) e sintéticos (s).

Complex wounds are characterized by complete loss of cutaneous cover. The most common plastic surgery technique is the autogenous skin graft; however, the amount of material available from donor areas is often limited. The development of synthetic or biological products as skin substitutes is therefore an area of interest. The present study aimed to classify the different types of skin substitutes available based on three criteria: the skin layer to be replaced, which can be categorized into epidermal (E), dermal (D), and dermal-epidermal composites (C); the durability in the wound bed, which can be temporary (T) or permanent (P); and the origin of the material, subdivided into biological (b), biosynthetic (bs), and synthetic (s).

Replacement of fetal calf serum by human serum as supplementation for human fibroblast culture / Substituição de soro bovino fetal por soro humano como suplemento para cultura de fibroblastos humanos

INTRODUCTION: Fetal calf serum (FCS) is commonly used as a supplement in the culture medium for fibroblast cells. This supplementation is far from ideal as sample quality varies from batch to batch and the composition of FCS is not completely known. In addition, FCS may be contaminated with viruses and/or prions and may also cause adverse immunologic responses in humans. Due to these facts, a worldwide effort is being made to find alternatives for xenobiotic elements in cell cultures. Human serum could be a safer alternative, especially for clinical application. METHODS: We investigated human serum as a substitute for FCS in human fibroblast culture. Fresh human serum was obtained from 10 healthy volunteers. Fibroblasts were cultivated in multiwell plates containing either Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) plus 10 percent FCS (D10) or DMEM plus 10 percent human serum (D10H). Cell counts were obtained between 24 and 264 hours of cultivation; results were expressed as the mean number of cells ± standard error of the mean to create cell proliferation curves. RESULTS: There was no statistical difference in fibroblast proliferation between the two groups. Human serum supported human fibroblast growth and proliferation, suggesting that it may be a potential substitute for FCS in human cell culture. Cells cultivated with human serum presented a different morphology, appearing smaller and more rounded as compared to cells cultivated in D10. CONCLUSIONS: These results demonstrate that human serum can be substituted for FCS in human fibroblasts culture and that fibroblasts cultivated in the presence of human serum have a morphology that is similar to in vivo fibroblasts.

INTRODUÇÃO: Soro bovino fetal (SBF) é comumente usado como suplemento no meio de cultura para cultivar fibroblastos. Essa forma de suplementação, porém, não é ideal, pois a qualidade das amostras de SBF é variada e sua composição não é completamente conhecida. Além disso, o SBF pode apresentar contaminação por vírus e príons ou causar complicações imunológicas. Assim, a comunidade científica tem buscado alternativas ao uso de elementos xenobióticos em cultura celular. O soro humano pode ser uma dessas alternativas, principalmente para aplicação clínica. MÉTODO: Soro humano, obtido de sangue de 10 voluntários saudáveis submetidos a avaliação sorológica prévia, foi testado como substituto do SBF em cultura de fibroblastos humanos. As células foram cultivadas em placas multipoços, contendo Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) mais 10 por cento de SBF (D10) ou DMEM mais 10 por cento de sroro humano (D10H). Entre 24 e 264 horas de exposição aos meios testados, as células foram contadas e os resultados foram expressos em média ± erro padrão da média, para obtenção de curvas de proliferação celular. RESULTADOS: Não houve diferença estatística entre os grupos de proliferação. Fibroblastos na presença de soro humano aparentavam ser menores e mais arredondados em comparação àqueles mantidos em D10. CONCLUSÕES: Os resultados permitem inferir que o soro humano pode substituir o SBF em cultura de fibroblastos e que fibroblastos cultivados em meio suplementado por soro humano apresentam morfologia mais semelhante àqueles in vivo.

Diferenciação de osteoblastos cultivados sobre superfícies de titânio modificados por irradiação com laser Yb: YAG pulsado de alta potencia / Differentiation of osteoblasts cultured on titanium surfaces modified by Yb: YAG high energy pulsed laser

A osseointegração, requisito indispensável para o sucesso dos implantes dentários, é um processo lento, caracterizado, sequencialmente, pelas etapas de adesão, diferenciação e proliferação celular, bem como pela aposição e mineralização da matriz óssea depositada por osteoblastos. Acelerar o processo de osseointegração significa reduzir o tempo de espera para a aplicação segura de uma carga funcional sobre os implantes de titânio (Ti). Sabe-se que vários fatores, tal como a topografia da superfície do Ti, influenciam diretamente o processo de osseointegração. Assim, desde que foi demonstrado que alguns padrões específicos de superfície do Ti são capazes de bio-estimular osteoblastos, favorecendo e acelerando a osseointegração, diversas técnicas de baixo custo, rápida execução e altamente reproduzíveis, tem sido propostas para tratar a superfície dos implantes. Desta maneira, o objetivo da presente pesquisa foi avaliar a capacidade de superfícies de Ti, modificadas com laser pulsado de alta potência (L) ou usinadas (U), de estimular a diferenciação e maturação de células obtidas de calvária de camundongos cultivadas sobre elas. Para isto, foram realizados ensaios laboratoriais para determinar a atividade mineralizadora das células (coloração com vermelho de alizarina e fosfatase alcalina), o metabolismo (MTT assay) e morfologia celular (MEV). A fim de melhor caracterizar a diferenciação de osteoblastos, foi realizada a reação de polimerização em cadeia (PCR) quantitativa em tempo real para analisar a expressão, pelas células cultivadas sobre as superfícies de Ti, de genes que codificam os fatores de transcrição Runx2 e Sp7 e proteínas específicas da matriz extracelular mineralizada (Spp1, Alpl, e Col1a1). Os dados numéricos obtidos foram submetidos a análise estatística. A superfície L foi capaz de aumentar a formação de nódulos de mineralização aos 14 dias em comparação com a superfície U (ensaio de vermelho de alizarina, p<0,05). Esta atividade mineralizadora, estimada também pela presença da enzima fosfatase alcalina, foi observada desde o período de 7 dias e se manteve até o dia 14. O ensaio de MTT revelou que esta maior capacidade mineralizadora não foi decorrente do aumento da proliferação celular, pois o metabolismo foi maior aos 14 dias em células cultivadas sobre a superfície U em comparação à superfície L (MTT assay, p<0,05). Os genes que codificam para fatores de transcrição estimuladores de diferenciação de osteoblastos (Runx2 e Sp7), assim como os genes que codificam para as proteínas osteopontina (Spp1), fosfatase alcalina (Alpl) e cadeia 1 do colágeno tipo 1 (Col1a1) foram aumentados no período entre 24 horas até os 14 dias em células cultivadas em contato com a superfície L. De acordo com a metodologia empregada neste estudo, foi possível concluir que a criação de topografias híbridas (micro, submicro e nano) com laser de alta potência bioestimula a diferenciação terminal de osteoblatos a partir de células obtidas de calvária de camundongos e acelera o processo biológico de síntese e mineralização de matriz óssea

The osseointegration, which plays a fundamental role in the dental implantation success, is characterized by cell adhesion, differentiation, proliferation as well as deposition and mineralization of of bone matriz by osteoblasts. To make the osseointegration process faster means reducing the period to apply a safe functional stress on the titanium (Ti) implants. A number of factors, such as the topographical surface of Ti enhances the osseointegration process. Different Ti surface treatments capable of bio-estimulating osteoblasts to accelerate the osseointegration have been evaluated. Current studies have shown that osseointegration of Ti devices is enhanced by surface roughness. In this way, the aim of the present investigation was to assess the capacity of Ti surfaces irradiated with high potency laser (L) or polished (U) to stimulate the differentiation and maturation of cells obtained from calvarian bone of mouse. Then, laboratorial protocols to evaluate the mineralizing cell activity (alizarin red assay), cell metabolism (MTT assay) as well as the morphology (SEM) of cells cultured on the Ti surfaces were carried out. To better characterize the osteoblast differentiation, the real time qPCR for expression of genes that code to the transcription factors Runx2 and Sp7 were performed. Additionaly, this protocol was also used to assess specific proteins of extracellular matrix (Spp1, Alpl, e Col1a1). The numeric data were subjected to statistical analysis. Our data demonstrated that the Ti surface L improved the osteoblast maturation capacity of calvarial osteoblasts grown over this surface. Scanning electron microscopy (SEM) revealed spheres and protrusions created by laser treatment. Laser profilometry showed a disordered surface with micrometric and/to nanometric scales features (Ra = 10.57µm). When compared to polished Ti (U), laser modified titanium (L) increased the nodule formation as well as the alkaline phosphatase (ALPase) activity at 7 and 14 days. These effects were not due to increased cell proliferation since no difference in metabolic activity on cells cultured over U and L surfaces after 1 and 3 days, and decreased activity after 7 days on L compared to U, as demonstrated by MTT assay. Relative quantification of gene expression (qPCR) revealed that transcription factors triggering osteoblast differentiation (Runx2 and Sp7) were up-regulated at 1, 3, 7 and 14 days on L surface. Genes encoding to the extracellular bone matrix proteins collagen type-1 (Col1a1) and osteopontin (Spp1) were also increased at 1, 3, 7 and 14 days. Alkaline phosphatase (Alpl) transcript was increased in osteoblasts after 3 an 14 days of culture on L surface as compared to M surface. Treatment of titanium with high power laser created a rough surface that stimulates osteoblast differentiation and maturation, which turn faster the biological process of synthesis and mineralization of bone matrix

Diferenciação de osteoblastos cultivados sobre superfícies de titânio modificados por irradiação com laser Yb: YAG pulsado de alta potencia / Differentiation of osteoblasts cultured on titanium surface modified by Yb: YAG high energy pulsed laser

A osseointegração, requisito indispensável para o sucesso dos implantes dentários, é um processo lento, caracterizado, sequencialmente, pelas etapas de adesão, diferenciação e proliferação celular, bem como pela aposição e mineralização da matriz óssea depositada por osteoblastos. Acelerar o processo de osseointegração significa reduzir o tempo de espera para a aplicação segura de uma carga funcional sobre os implantes de titânio (Ti). Sabe-se que vários fatores, tal como a topografia da superfície do Ti, influenciam diretamente o processo de osseointegração. Assim, desde que foi demonstrado que alguns padrões específicos de superfície do Ti são capazes de bio-estimular osteoblastos, favorecendo e acelerando a osseointegração, diversas técnicas de baixo custo, rápida execução e altamente reproduzíveis, tem sido propostas para tratar a superfície dos implantes. Desta maneira, o objetivo da presente pesquisa foi avaliar a capacidade de superfícies de Ti, modificadas com laser pulsado de alta potência (L) ou usinadas (U), de estimular a diferenciação e maturação de células obtidas de calvária de camundongos cultivadas sobre elas. Para isto, foram realizados ensaios laboratoriais para determinar a atividade mineralizadora das células (coloração com vermelho de alizarina e fosfatase alcalina), o metabolismo (MTT assay) e morfologia celular (MEV). A fim de melhor caracterizar a diferenciação de osteoblastos, foi realizada a reação de polimerização em cadeia (PCR) quantitativa em tempo real para analisar a expressão, pelas células cultivadas sobre as superfícies de Ti, de genes que codificam os fatores de transcrição Runx2 e Sp7 e proteínas específicas da matriz extracelular mineralizada...

The osseointegration, which plays a fundamental role in the dental implantation success, is characterized by cell adhesion, differentiation, proliferation as well as deposition and mineralization of of bone matriz by osteoblasts. To make the osseointegration process faster means reducing the period to apply a safe functional stress on the titanium (Ti) implants. A number of factors, such as the topographical surface of Ti enhances the osseointegration process. Different Ti surface treatments capable of bio-estimulating osteoblasts to accelerate the osseointegration have been evaluated. Current studies have shown that osseointegration of Ti devices is enhanced by surface roughness. In this way, the aim of the present investigation was to assess the capacity of Ti surfaces irradiated with high potency laser (L) or polished (U) to stimulate the differentiation and maturation of cells obtained from calvarian bone of mouse. Then, laboratorial protocols to evaluate the mineralizing cell activity (alizarin red assay), cell metabolism (MTT assay) as well as the morphology (SEM) of cells cultured on the Ti surfaces were carried out. To better characterize the osteoblast differentiation, the real time qPCR for expression of genes that code to the transcription factors Runx2 and Sp7 were performed. Additionaly, this protocol was also used to assess specific proteins of extracellular matrix (Spp1, Alpl, e Col1a1). The numeric data were subjected to statistical analysis. Our data demonstrated that the Ti surface L improved the osteoblast maturation capacity of calvarial osteoblasts grown over this surface. Scanning electron microscopy (SEM) revealed spheres and protrusions created by laser treatment. Laser profilometry showed a disordered surface with micrometric and/to nanometric scales features (Ra = 10.57μm). When compared to polished...

Cultivo de células mesenquimais do sangue de cordão umbilical com e sem uso do gradiente de densidade Ficoll-Paque / Blood mesenchymal stem cell culture from the umbilical cord with and without Ficoll-Paque density gradient method

OBJETIVOS: Implantação de técnicas de isolamento e cultivo de células-tronco mesenquimais do sangue de cordão umbilical humano, com e sem uso de gradiente de densidade Ficoll-Paque (d=1,077g/ml). MÉTODOS: Dez amostras de sangue de cordão umbilical humano de gestação a termo foram submetidas a dois procedimentos de cultivo de células-tronco mesenquimais: sem gradiente de densidade Ficoll-Paque e com gradiente de densidade. As células foram semeadas em frascos de 25cm² a uma densidade de 1x10(7)células nucleadas/cm² (sem Ficoll) e 1,0x10(6) células mononucleares/cm² (com Ficoll). As células aderentes foram submetidas a marcação citoquímica com fosfatase ácida e reativo de Schiff. RESULTADOS: No procedimento sem gradiente de densidade Ficoll, foram obtidas 2,0-13,0x10(7) células nucleadas (mediana=2,35x10(7)) e, no procedimento com gradiente de densidade Ficoll, foram obtidas 3,7-15,7x10(6) células mononucleares (mediana=7,2x10(6)). Em todas as culturas foram observadas células aderentes 24 horas após o início de cultivo. As células apresentaram morfologias fibroblastóides ou epitelióides. Na maioria das culturas houve proliferação celular nas primeiras semanas de cultivo, mas após a segunda semana, somente três culturas provenientes do método sem gradiente de densidade Ficoll-Paque mantiveram crescimento celular, formando focos confluentes de células. Essas culturas foram submetidas a várias etapas de tripsinização para espalhamento ou subdivisão e permaneceram em cultivo por períodos que variaram de dois a três meses. CONCLUSÃO: Nas amostras estudadas, o isolamento e cultivo de células-tronco mesenquimais do sangue de cordão umbilical humano pelo método sem gradiente de densidade Ficoll-Paque foi mais eficiente do que o método com gradiente de densidade Ficoll-Paque.

OBJECTIVES: Implantation of cell separation and mesenchymal stem cell culture techniques from human umbilical cord blood with and without using the Ficoll-Paque gradient density method (d=1.077g/ml). METHODS: Ten samples of the umbilical cord blood obtained from full-term deliveries were submitted to two different procedures of mesenchymal stem cell culture: a) Method without the Ficoll-Paque density gradient, which concentrates all nucleated cells; b) Method with the Ficoll-Paque density gradient, which selects only low-density mononuclear cells. Cells were initially plated into 25 cm² cultures flasks at a density of 1x10(7) nucleated cells/cm² and 1x10(6) mononuclear cells/cm². RESULTS: It was obtained 2-13x10(7) (median = 2.35x10(7)) nucleated cells/cm² by the method without the Ficoll-Paque gradient density, and 3.7-15.7x10(6) (median = 7.2x10(6)) mononuclear cells/cm² by the method with the Ficoll-Paque gradient density. In all cultures adherent cells were observed 24 hours after being cultured. Cells presented fibroblastoid and epithelioid morphology. In most of the cultures, cell proliferation occurred in the first week, but after the second week only some cultures - derived from the method without the Ficoll-Paque gradient density - maintained the growth rate reaching confluence. Those cultures were submitted to trypsinization with 0.25 percent trypsin/EDTA solution and cultured for two to three months. CONCLUSION: In the samples analyzed, cell separation and mesenchymal stem cell culture techniques from human umbilical cord blood by the method without the Ficoll-Paque density gradient was more efficient than the method with the Ficoll-Paque density gradient.

Experimental model for collagen estimation in cell culture

In the study of Plastic Surgery, cell culture may be used at experimental level in researches concerning biosynthesis functions of skin cells such as fibroblasts, keratinocytes, adipocytes, chondrocytes and osteocytes. The present study reports an experimental model for estimation of collagen in cell cultures using chromogenic precipitation reaction with an especific dye (Sirius Red).

Dentro do estudo da Cirurgia Plástica, a cultura de células pode ser utilizada em experimentos relativos às funções de biossíntese de células relacionadas com a pele tais como fibroblastos, queratinócitos, adipócitos, condrócitos e osteócitos. O presente estudo relata modelo experimental para a mensuração estimada do colágeno em cultura de células utilizando-se uma reação de precipitação cromogênica com um corante específico (Sirius Red).

Experimental model for establishment of hypoxia in 75 cm² culture flasks

In Plastic Surgery, cell culture represents the perspective of studying cellular mechanisms that guide the healing process of several tissues. Some steps of the healing process depend on physical factors as the tissular partial pressure of O2. In cell culture, it is possible to submit cells to hypoxic enviroment. The present study reports an alternative method at low cost for the establishment of hypoxic environment in cell culture flasks.

A cultura de células, na Cirurgia Plástica, representa uma perspective para o estudo dos mecanismos celulares que norteiam o processo cicatricial de diversos tecidos. Algumas etapas do processo de cicatrização dependem de fatores físicos como a pressão parcial de O2. Em uma cultura de células, é possível submeter células a um ambiente hipóxico. O presente estudo relata um método alternativo de baixo custo para o estabelecimento de um ambiente hipóxico em frascos de cultura de células.

Experimental model of cultured skin graft

One of the most used animal models of cultured keratinocytes autografting is based on xenografting of human keratinocytes to the rat or athymic mice, immunological neutral recipient that acts as biological carrier. It could be studied in this model many facts that occur after transplant without the ethical aspect in the clinical study. The proposition of the experimental model is related to the sequence of the total or partial skin transplant, as autografting or xenografting, cultured or not, to the back of athymic mice. The model presents the possibility of study in vivo athymic animal, when the in vivo study in anima nobili is not ethical. It permits the xenografting evaluation of cultured cells graft or of the genetically modified cells and of the association of the cultured cells and the dermal substitutes, the composite grafts, and of the autografting.

Um dos modelos animais mais utilizados de auto-enxertia de queratinócitos cultivados é baseado em xeno-enxerto de queratinócitos humanos em rato atímico, um receptor imunologicamente neutro que atua como carreador biológico. Muitos fatos podem ser estudados nesse modelo que acontecem após o transplante sem os aspectos éticos do estudo clínico. A proposição do modelo experimental esta relacionada a sequência do transplante de pele parcial ou total como auto-enxerto ou xeno-enxerto, cultivado ou não, no dorso do rato atímico. O modelo apresenta a possibilidade do estudo in vivo do animal atímico, quando o estudo in vivo em anima nobili não é considerado ético. Isso permite a avaliação do xeno-enxerto de células humanas normais ou modificadas geneticamente modificadas cultivadas e a associação de células cultivadas e substitutes dérmicos, de enxertos compostos e de auto-enxerto.