RESUMEN
Single-cell microcultures (SCMs) form a monosynaptic circuit that allows stimulation and recording of postsynaptic responses using a single electrode. Here, we present a protocol to establish autaptic cultures from rat superior cervical ganglion neurons. We describe the steps for preparing SCMs, recording synaptic currents, and identifying and processing the recorded neurons for electron microscopy. We then detail procedures for visualizing synapses. This protocol is illustrated by correlating evoked and spontaneous neurotransmitter release with the ultrastructural features of synapses recorded. For complete details on the use and execution of this protocol, please refer to Velasco et al.1.
Asunto(s)
Neuronas , Animales , Ratas , Neuronas/citología , Neuronas/fisiología , Neuronas/ultraestructura , Microscopía Electrónica/métodos , Sinapsis/fisiología , Sinapsis/ultraestructura , Sinapsis/metabolismo , Electrofisiología/métodos , Técnicas de Cultivo de Célula/métodos , Ganglio Cervical Superior/citología , Células Cultivadas , Fenómenos Electrofisiológicos , Análisis de la Célula Individual/métodosRESUMEN
Se estudió la interrelación del factor de crecimiento nervioso (FCN) y el óxido nítrico (NO) sobre los procesos de diferenciación neuronal. Se cultivaron durante 24 horas células provenientes del ganglio cervical superior (GCS), que producen sintetasa del óxido nítrico (SON) y dependen mucho del FCN para su desarrollo. Usando una pinza de Patch se midieron la capacitancia de la membrana (CM) y la corriente máxima de Ca2+ a través de los canales de N. El desarrollo morfológico de los cultivos fotografiados se relacionó con la CM. Todos los grupos experimentales presentaron desarrollo neurítico. Las células incubadas con nitroprusiato de sodio (NPS) o 8-Br-GMPc sin FCN sobrevivieron hasta las 72 horas. La CM y la DICa aumentaron significativamente (p<0.05) en las células incubadas con FCN, NPS u 8-Br-GMPc en relación con las células control; sin embargo, el uso de FCN con L-NAME sólo incrementó los valores de la CM, la DICa no se incrementó en este grupo. Nuestros resultados sugieren que la vía intracelular de signalización iniciada por el FCN para inducir el desarrollo neurítico es diferente de la que desencadena un incremento de DICa a través de los canales de N; esta última implica la participación del NO a través de la GMPc