A procedure for cloning genomic DNA fragments with increasing thermoresistance.

Genomic DNAs have been cleaved by restriction or sonication, and the resulting double-stranded fragments have been exposed to increasing temperatures. This treatment may induce the helix-coil transition either in a single or in several steps, depending on the size and composition of the duplexes. Eventually, a critical temperature is reached at which each duplex melts completely and the two constitutive single strands separate. A transition interval can thus be defined for each duplex by the temperature at which the earliest strand separation takes place and that at which the most resistant double-stranded core collapses. If solutions containing a mixture of DNA duplexes are exposed to temperatures within their transition intervals, three kinds of molecules should originate: (1) duplexes that have not yet initiated the melting phase; (2) duplexes that have undergone only partial melting; and (3) single strands that derive from fully melted duplexes. If the heated solutions are quickly cooled to 0 degreesC, only the molecules from the first two classes can be ligated to a compatibly ended vector and cloned: class (1) are intact duplexes, and class (2) are molecules that snap immediately back to fully duplex structures: both are double-stranded. Conversely, the single strands of class (3) may not reanneal and thus be neither ligated nor cloned. We have tested the procedure on restricted coliphage lambda DNA, in view of its compartmentalized organization and known sequence. Then, we have applied it to human genomic DNA fragmented by sonication. After cloning of the available duplexes in a bacterial plasmid, libraries of molecules endowed with a progressively higher thermoresistance can be prepared for thermodynamic and genomic studies.

Osteosarcoma en niños y adolescentes: reporte definitivo del brazo pediátrico del grupo cooperativo venezolano para el estudio de los tumores óseos (GCVETO): octubre 1995-diciembre 1999 / Osteosarcoma in children and adolescen: report definitive of the arm pediatric of the group cooperative venexuelan for study od the tumors osseous (GCVETO): octuber 1995-december 1999

En 1995 se integró el GCVETO, y en octubre 1995 se inicia el Protocolo 003/95 para el estudio y tratamiento del Osteosarcoma (OS). Durante el período comprendido entre el 01.10.1995 y el 31.12.1999, 39 pacientes menores de 20 años ingresaron al brazo pediátrico del protocolo 003/95. El esquema de quimioterapia incluyó: Ifosfamida (IFOS)/Mesna 1800 mgr/m²/día/5 días, Doxorubicina (DOXO) 25 mgr/m²/día/3 días asociado a ICRF-187 (Desraxozane)250 mgr/m²/día/3 días, Cisdiaminodicloroplatino (CDDP) 40 mgr/m²/día/3 días. 64,10 por ciento eran varones, con una relación sexo V:H 1,78:1. 53,84 por ciento tenían edades comprendidas entre 10 y 15 años, edad mínima 6 a. y máxima 20 a., con un promedio de 12,53 a. Dolor, aumento de volumen e incapacidad funcional fueron los datos clínicos más frecuentes. 100 por ciento de los casos presentaban compromiso de partes blandas, y en 30,78 por ciento el volumen tumoral fue > 20 cm. El sitio de localización más frecuente: Femúr 48,7 por ciento, seguido por Tibia 23,07 por ciento y Húmero 20,51 por ciento. 14 pacientes presentaron enfermedad metastásica al ingreso. Las alteraciones de laboratorio más relevantes: Velocidad Sedimentación Globular (VSG), niveles séricos de Fosfatasa Alcalina (FA) y Deshidrogenasa Láctica (LDH). Los estudios imagenológicos del hueso comprometido fueron positivos en todos los casos, orientando el diagnóstico clínico en el 100 por ciento de los mismos. En todos los casos se estableció el diagnóstico a través del estudio histológico. 34 pacientes (87,18 por ciento) se consideraron evaluables para la terapia. Cirugía definitiva se realiza en el 61,76 de los casos: Injerto Oseo 11 pacientes, Desarticulación 8 pacientes, Resección tumoral 1 paciente, Amputación 1 paciente, Endoprótesis 1 paciente. 226 cursos de quimioterapia fueron administrados, promedio de 5,79 ciclos. 17 pacientes (50 por ciento) han finalizado la terapia. La respuesta histológica se evaluó según porcentaje de necrosis sólo en 16 pacientes (72,72 por ciento): Grado I 2/16, Grado II 3/16, Grado III 7/16, Grado IV 3/16, N.R. 6/22. R.C., fue obtenida en 19 pacientes (55,88 por ciento): 16/22 pacientes sin enfermedad metastásica y 3/12 con enfermedad metastásica. R.P. 13 pacientes, Progresión 2 pacientes, 8 pacientes fallaron a la terapia: Los sitios de recaída más frecuentes: Pulmón y Hueso (50 por ciento)