Physiological roles and potential therapeutic applications of the P2X7 receptor in inflammation and pain.

The P2X7 receptor (P2X7R) is a nonselective cation channel that is activated by extracellular ATP and triggers the secretion of several proinflammatory substances, such as IL-1ß, IL-18, TNF-α, and nitric oxide. Recently, several preclinical studies have demonstrated that this receptor participates in inflammation and pain mechanisms. Taken together, these results indicate that P2X7R is a promising pharmacological target, and compounds that modulate the function of this receptor show potential as new anti-inflammatory medicines. In this review, we discuss aspects of P2X7R pharmacology and the participation of this protein in inflammation and pain and provide an overview of some promising compounds that have been tested as antagonists of P2X7R, with clinical applicability.

Nitric oxide biosynthesis by Leishmania amazonensis promastigotes containing a high percentage of metacyclic forms.

Due to the diversity of its physiological and pathophysiological functions and general ubiquity, the study of nitric oxide (NO) has become of great interest. In this work, it was demonstrated that Leishmania amazonensis promastigotes produces NO, a free radical synthesized from L: -arginine by nitric oxide synthase (NOS). A soluble NOS was purified from L. amazonensis promastigotes by affinity chromatography (2', 5'-ADP-agarose) and on SDS-PAGE the enzyme migrates as a single protein band of 116.2 (+/-6) kDa. Furthermore, the presence of a constitutive NOS was detected through indirect immunofluorescence using anti-cNOS and in NADPH consumption assays. The present work show that NO production, detected as nitrite in culture supernatant, is prominent in promastigotes preparations with high number of metacyclic forms, suggesting an association with the differentiation and the infectivity of the parasite.

Triagem de extratos vegetais e fúngicos de diferentes biomas para identificação de antagonistas do receptor P2X7 / Screening of plant and fungal extracts of various biomass for the identification of P2X7 receptor antagonists

O P2X7 é um receptor purinérgico que está envolvido em importantes funções fisiológicase metabólicas, mas também tem participação em diversas patologias, principalmente aquelas decaráter inflamatório. Apesar de sua relevância, ainda não se têm disponíveis antagonistasespecíficos que possam ser utilizados na clínica para o tratamento de doenças relacionadas àativação deste receptor. Muitos fármacos comercializados nos dias de hoje apresentam estruturasquímicas relacionadas a um produto natural extraído de alguma espécie botânica de uso consagradona medicina popular. Baseia-se nisso a relevância do estudo de produtos naturais para obtenção deuma atividade específica sobre alvos celulares. Logo, esse trabalho teve como interesse o estudo deextratos vegetais e fúngicos obtidos de espécies dos diferentes biomas, cedidos pelo LQPN doCentro de Pesquisas René Rachou Fiocruz-MG, visando á identificação de antagonistas para oreceptor P2X7. Nosso primeiro passo foi à padronização de uma metodologia que permitiu atriagem de cerca de 60 extratos ao mesmo tempo, através da utilização de um espectrofotômetro deplacas. Depois de padronizada, promovemos a aplicação dessa metodologia na triagem de 1800extratos, dos quais apenas três extratos (8067,8549 e 8568) apresentaram atividade antagonista nafaixa de corte pré-estabelecida [100 mig/mL], com perfis de inibição de 65 por cento, 62 por cento e 61 por centorespectivamente, sobre o P2X7R. Destes extratos foram determinados os IC´s50 tanto em células delinhagem murina (2,1 mig/mL; 2.6 mig/mL e 3.8 mig/mL) quanto em células de linhagem humana(0.69, 0.92 e 1.5 mig/mL), sendo possível verificar maior atividade quando testados em células delinhagem humana.

Posteriormente avaliamos a ação destes sobre funções fisiológicas relacionadas à ativação do P2X7R, nessa etapa, observamos o efeito inibitório destes extratos sobre a liberação deIL-1beta, ROS e NO, onde os três compostos foram capazes de inibir estas funções numa faixa entre 50 por cento a 60 por cento. Para obtermos uma caracterização do efeito farmacológico destes extratos sobre o receptor P2X7, realizamos experimentos de eletrofisiologia, caracterizando assim uma ação inibitória dose-dependente destes, sendo que nos respectivos IC´s50 os perfis de inibição da corrente foram de: 76 por cento, 47 por cento e 75 por cento. Também avaliamos a citotoxicidade in vitro utilizando as células de ambas às linhagens e verificamos que não apresentaram significativa toxicidade quando tratadas por 24 h. em doses até quatro vezes maiores que o IC50, visto que os resultados foram semelhantes ao controle não tratado. Depois de avaliarmos a atividade antagonista destes extratos in vitro, partimos para os experimentos in vivo utilizando os modelos de úlcera induzida por etanol e de dor neuropática e inflamatória, pois existem trabalhos previamente descritos na literatura que correlacionam a atividade do P2X7R com a evolução dessas patologias. No ensaio de dorneuropática, apenas dois extratos mostraram atividade analgésica (8067 e 8549) inibindo o estímulo de dor em 68 por cento e 66 por cento, porém no contexto da dor inflamatória os três extratos mostraram efeitoanalgésico, inibindo o estímulo em: 8067 = 48 por cento, 8549 = 50 por cento e 8568 = 44 por cento. Os resultados obtidos do experimento de úlcera induzida por etanol demonstraram o efeito inibitório sobre a formação de úlceras desses extratos em: 88 por cento, 84 por cento e 51 por cento, inclusive foram mais efetivos que o BBG(antagonista reversível deste receptor) e que o medicamento utilizado na clínica (Lansoprazol), os quais inibiram a formação de úlceras em 43 por cento e 46 por cento respectivamente.

Nosso conjunto deresultados apontam extratos com significativa atividade antagonista sobre o P2X7R, com potencialpara o desenvolvimento de novos fármacos com grande interesse para a indústria farmacêutica,além de contribuir para o conhecimento acerca de propriedades medicinais presentes nabiodiversidade. (AU)

Triagem de extratos vegetais e fúngicos de diferentes biomas para identificação de antagonistas do receptor P2X7

O P2X7 é um receptor purinérgico que está envolvido em importantes funções fisiológicas e metabólicas, mas também tem participação em diversas patologias, principalmente aquelas de caráter inflamatório. Apesar de sua relevância, ainda não se têm disponíveis antagonistas específicos que possam ser utilizados na clínica para o tratamento de doenças relacionadas à ativação deste receptor. Muitos fármacos comercializados nos dias de hoje apresentam estruturas químicas relacionadas a um produto natural extraído de alguma espécie botânica de uso consagrado na medicina popular. Baseia-se nisso a relevância do estudo de produtos naturais para obtenção de uma atividade específica sobre alvos celulares. Logo, esse trabalho teve como interesse o estudo de extratos vegetais e fúngicos obtidos de espécies dos diferentes biomas, cedidos pelo LQPN do Centro de Pesquisas René Rachou \2013 Fiocruz-MG, visando á identificação de antagonistas para o receptor P2X7. Nosso primeiro passo foi à padronização de uma metodologia que permitiu a triagem de cerca de 60 extratos ao mesmo tempo, através da utilização de um espectrofotômetro de placas. Depois de padronizada, promovemos a aplicação dessa metodologia na triagem de 1800 extratos, dos quais apenas três extratos (8067,8549 e 8568) apresentaram atividade antagonista na faixa de corte pré-estabelecida [100 \03BCg/mL], com perfis de inibição de 65 %, 62 % e 61 % respectivamente, sobre o P2X7R. Destes extratos foram determinados os IC´s50 tanto em células de linhagem murina (2,1 \03BCg/mL; 2.6 \03BCg/mL e 3.8 \03BCg/mL) quanto em células de linhagem humana (0.69, 0.92 e 1.5 \03BCg/mL), sendo possível verificar maior atividade quando testados em células de linhagem humana Posteriormente avaliamos a ação destes sobre funções fisiológicas relacionadas à ativação do P2X7R, nessa etapa, observamos o efeito inibitório destes extratos sobre a liberação de IL-1beta, ROS e NO, onde os três compostos foram capazes de inibir estas funções numa faixa entre 50 % a 60 %. Para obtermos uma caracterização do efeito farmacológico destes extratos sobre o receptor P2X7, realizamos experimentos de eletrofisiologia, caracterizando assim uma ação inibitória dose-dependente destes, sendo que nos respectivos IC´s50 os perfis de inibição da corrente foram de: 76 %, 47 % e 75 %. Também avaliamos a citotoxicidade in vitro utilizando as células de ambas às linhagens e verificamos que não apresentaram significativa toxicidade quando tratadas por 24 h. em doses até quatro vezes maiores que o IC50, visto que os resultados foram semelhantes ao controle não tratado. Depois de avaliarmos a atividade antagonista destes extratos in vitro, partimos para os experimentos in vivo utilizando os modelos de úlcera induzida por etanol e de dor neuropática e inflamatória, pois existem trabalhos previamente descritos na literatura que correlacionam a atividade do P2X7R com a evolução dessas patologias. No ensaio de dor neuropática, apenas dois extratos mostraram atividade analgésica (8067 e 8549) inibindo o estímulo de dor em 68 % e 66 %, porém no contexto da dor inflamatória os três extratos mostraram efeito analgésico, inibindo o estímulo em: 8067 = 48%, 8549 = 50% e 8568 = 44 % Os resultados obtidos do experimento de úlcera induzida por etanol demonstraram o efeito inibitório sobre a formação de úlceras desses extratos em: 88 %, 84 % e 51 %, inclusive foram mais efetivos que o BBG (antagonista reversível deste receptor) e que o medicamento utilizado na clínica (Lansoprazol), os quais inibiram a formação de úlceras em 43 % e 46% respectivamente. Nosso conjunto de resultados apontam extratos com significativa atividade antagonista sobre o P2X7R, com potencial para o desenvolvimento de novos fármacos com grande interesse para a indústria farmacêutica, além de contribuir para o conhecimento acerca de propriedades medicinais presentes na biodiversidade

Triagem de extratos vegetais e fúngicos de diferentes biomas para identificação de antagonistas do receptor P2X7 / Screening of plant and fungal extracts of various biomass for the identification of P2X7 receptor antagonists

O P2X7 é um receptor purinérgico que está envolvido em importantes funções fisiológicase metabólicas, mas também tem participação em diversas patologias, principalmente aquelas decaráter inflamatório. Apesar de sua relevância, ainda não se têm disponíveis antagonistasespecíficos que possam ser utilizados na clínica para o tratamento de doenças relacionadas àativação deste receptor. Muitos fármacos comercializados nos dias de hoje apresentam estruturasquímicas relacionadas a um produto natural extraído de alguma espécie botânica de uso consagradona medicina popular. Baseia-se nisso a relevância do estudo de produtos naturais para obtenção deuma atividade específica sobre alvos celulares. Logo, esse trabalho teve como interesse o estudo deextratos vegetais e fúngicos obtidos de espécies dos diferentes biomas, cedidos pelo LQPN doCentro de Pesquisas René Rachou – Fiocruz-MG, visando á identificação de antagonistas para oreceptor P2X7. Nosso primeiro passo foi à padronização de uma metodologia que permitiu atriagem de cerca de 60 extratos ao mesmo tempo, através da utilização de um espectrofotômetro deplacas. Depois de padronizada, promovemos a aplicação dessa metodologia na triagem de 1800extratos, dos quais apenas três extratos (8067,8549 e 8568) apresentaram atividade antagonista nafaixa de corte pré-estabelecida [100 mig/mL], com perfis de inibição de 65 por cento, 62 por cento e 61 por centorespectivamente, sobre o P2X7R. Destes extratos foram determinados os IC´s50 tanto em células delinhagem murina (2,1 mig/mL; 2.6 mig/mL e 3.8 mig/mL) quanto em células de linhagem humana(0.69, 0.92 e 1.5 mig/mL), sendo possível verificar maior atividade quando testados em células delinhagem humana...

Avaliação da modulação das atividades da óxido nítrico sintase (NOS)/arginase como participantes do sistema de defesa de Leishmania amazonensis frente a derivados de compostos mesoiônicos / Evaluation of the modulation of the activities of nitric oxide synthase(NOS)/arginase as participant of the system of defense of Leishmania amazonensis front the mesoionic compounds derivatives

A L-arginina está envolvida na produção de óxido nítrico (NO) e citrulina, mediada pela óxido nítrico sintase (NOS), e L-omitina e uréia, por atividade da arginase. A regulação de NOS ocorre principalmente em nível transcricional. Trabalhos prévios de nosso grupo demonstram a atividade de NOS em parasitos do gênero Leishmania. A atividade da arginase e sua sequência genética também foram descritas na literatura para estes parasitos. Em busca de novos alvos intracelulares do parasito para ação de agentes leishmanicidas, foram realizados ensaios com derivados mesoiônicos da classe dos 1,3,4-tiadiazóis e das arilsidnonas. Os parasitos foram analisados em ausência/presença de derivados 4-e 3-metoxilados, a fim de verificar o efeito sobre a produção de NO e sobre a atividade de arginase de L. amazonensis. Os resultados indicaram que as drogas testadas reduziram de 70 a 90por cento a produção NO pelo parasito, e que os mesmos são capazes de diminuir a atividade da NOS solúvel constitutiva purificada de promastigotas e amastigotas axênicas de L. amazonensis. Além disso, ensaios realizados com 4-fenil-5-(4-X-fenil)-1,2,3-tiadiazólio-2-fenilaminida, onde X=H (MI-H), No2 (MI-NO2) ou OCH3 (MI-OCH3) e 3[N-4-X-fenil]-1,2,3-oxadiazólio-5-olato, onde X=H (SID-H), NO2 (SID-NO2) ou OCH3 (SID-OCH3) demonstraram maior eficácia contra amastigotas axênicas, em comparação com o Isetionato de Pentamidina. Os ensaios de citotoxicidade para macrófagos peritoneais murinos demonstraram que tais derivados apresentam baixa toxicidade (10por cento). A maioria dos derivados testados não afetou significantemente a atividade da arginase de L. amazonensis.(AU)

Avaliação da modulação das atividades da óxido nítrico sintase (NOS)/arginase como participantes do sistema de defesa de Leishmania amazonensis frente a derivados de compostos mesoiônicos / Evaluation of the modulation of the activities of nitric oxide synthase(NOS)/arginase as participant of the system of defense of Leishmania amazonensis front the mesoionic compounds derivatives

A L-arginina está envolvida na produção de óxido nítrico (NO) e citrulina, mediada pela óxido nítrico sintase (NOS), e L-omitina e uréia, por atividade da arginase. A regulação de NOS ocorre principalmente em nível transcricional. Trabalhos prévios de nosso grupo demonstram a atividade de NOS em parasitos do gênero Leishmania. A atividade da arginase e sua sequência genética também foram descritas na literatura para estes parasitos. Em busca de novos alvos intracelulares do parasito para ação de agentes leishmanicidas, foram realizados ensaios com derivados mesoiônicos da classe dos 1,3,4-tiadiazóis e das arilsidnonas. Os parasitos foram analisados em ausência/presença de derivados 4-e 3-metoxilados, a fim de verificar o efeito sobre a produção de NO e sobre a atividade de arginase de L. amazonensis. Os resultados indicaram que as drogas testadas reduziram de 70 a 90% a produção NO pelo parasito, e que os mesmos são capazes de diminuir a atividade da NOS solúvel constitutiva purificada de promastigotas e amastigotas axênicas de L. amazonensis. Além disso, ensaios realizados com 4-fenil-5-(4-X-fenil)-1,2,3-tiadiazólio-2-fenilaminida, onde X=H (MI-H), No2 (MI-NO2) ou OCH3 (MI-OCH3) e 3[N-4-X-fenil]-1,2,3-oxadiazólio-5-olato, onde X=H (SID-H), NO2 (SID-NO2) ou OCH3 (SID-OCH3) demonstraram maior eficácia contra amastigotas axênicas, em comparação com o Isetionato de Pentamidina. Os ensaios de citotoxicidade para macrófagos peritoneais murinos demonstraram que tais derivados apresentam baixa toxicidade (10por cento). A maioria dos derivados testados não afetou significantemente a atividade da arginase de L. amazonensis.