Aislamiento de citomegalovirus humano a partir de fluidos corporales / Isolation of the human cytomegalovirus from bodily fluids

ABSTRACT

ABSTRACT In vitro studies on the pathogenesis of the human cytomegalovirus (HCMV) are conducted regularly using laboratory adapted strains that lose some characteristics during the adaptation process. Since HCMV is excreted from bodily fluids during infection or reactivation, this work aimed to isolate and culture HCMV from the MRC-5 human cells found in the urine, bronchoalveolar lavage, saliva, and plasma samples of pediatric patients with probable or confirmed infection. The samples were inoculated on cell cultures either for 14 days or until a cytopathic effect (CPE) of 80 % was observed. The cell lysates and supernatants were used to perform successive viral passages. Besides HCMV, the herpes simplex virus was detected from all the saliva samples. Inoculation of the HCMV positive sera induced cell clustering and immediate monolayer damage that restricted their use. One sample of bronchoalveolar lavage induced a CPE after inoculation like that of the HCMV reference strains (Towne and Merlin), which was consequently propagated and titrated. A second viral isolate derived from the urine sample of a patient with congenital infection did not demonstrate a CPE, although presence of the virus had been confirmed using PCR. The viral isolates were examined and found to be negative for adenoviruses or enteroviruses. Despite the evident difficulty encountered for the isolation and harvesting of the HCMV, this work shows that it was possible to obtain a low passage viral strain using a modified shell vial method and inoculation protocol with extended follow-up and confirmation.

RESUMEN

RESUMEN Estudios in vitro de la patogénesis del citomegalovirus humano (HCMV) se hace empleando cepas adaptadas de laboratorio que han perdido algunas de sus características durante ese proceso. En vista que el HCMV se excreta en distintos fluidos corporales, dependiendo de la condición clínica del paciente, en este trabajo se propuso aislar y propagar HCMV en fibroblastos MRC-5 usando muestras de orina, lavado broncoalveolar, saliva y plasma de pacientes pediátricos. Estas muestras fueron inoculadas sobre los cultivos celulares por 14 días o hasta alcanzar un efecto citopático en el 80 % de la monocapa. El lisado celular y el sobrenadante del aislamiento se usaron para hacer pasajes virales sucesivos. Además de HCMV, el virus de herpes simple se aisló en todas las muestras de saliva. Con el empleo de los sueros positivos para HCMV se observó la formación de agregados y daño inmediato en la monocapa que impidieron su uso. Una muestra de lavado broncoalveolar indujo ECP desde la inoculación, similar al control positivo para HCMV (cepas Towne y Merlin), por lo que fue propagada y se tituló. Un segundo aislamiento viral obtenido de la orina de un paciente con infección congénita no produjo ECP a pesar de ser confirmado por PCR. En los aislamientos llevados hasta el pasaje 1, se descartó la presencia de enterovirus y adenovirus. A pesar de la evidente dificultad para aislar y propagar el HCMV, fue posible obtener un aislamiento usando un protocolo de Shell vial e inoculación modificado, y con un seguimiento prolongado del proceso.