Efficiency of rLb6H recombinant protein from Leishma-nia (Viannia) braziliensis for the detection of canine visceral leishmaniasis / Eficiência da proteína recombinante rLb6H de Leishmania (Viannia) brazi-liensis na detecção da leishmaniose visceral canina

Introduction: Visceral leishmaniasis (VL) is a serious endemic disease in many tropical and subtropical countries, with a strong incidence in Brazil. The disease is transmitted by the bite of infected female phlebotomine sandflies, with dogs being the main urban reservoirs of the parasite. The diverse clinical profile and the long incubation period are challenges for the diagnosis of canine visceral leishmaniasis (CVL). Recombinant proteins from Leishmania spp. have been studied as antigens that can increase the accuracy of serological tests. Objective: To evaluate the diagnostic performance of the recombinant protein rLb6H, from Leishmania braziliensis, in comparison to the reference antigens rK39 and rK28, from L. donovani, prioritizing the identification of subclinical infected dogs. Material and Methods: Serum IgG reactivity to rLb6H, rK28, and rK39 recombinant proteins was assessed in dogs with previously parasitological confirmation of CVL, subdivided according to their clinical status, using immunoenzymatic assay (ELISA). Diagnostic accuracy of each ELISA was evaluated by receiver operating characteristic (ROC) curve analysis. Results: While all antigens showed a better performance in detecting CVL in symptomatic dogs (SD), detection of CVL in the oligosymptomatic (OD) and asymptomatic (AD) groups was lower, but rLb6H achieved high sensitivity for asymptomatic CVL. Interestingly, the most reactive CVL samples to rK28 were barely detected by rLb6H, while the less reactive to rK28, mostly from the AD group, presented higher reactivity to rLb6H. Conclusion: The recombinant protein rLb6H showed utility in the detection of asymptomatic CVL, displaying a complementary reactivity to rK39 and rK28. Thus, these results suggest that rLb6H could be incorporated into multi-antigen strategies, to increase diagnostic accuracy of CVL.

Introdução: A leishmaniose visceral (LV) é uma doença endêmica grave em muitos países tropicais e subtropicais, tendo forte incidência no Brasil. A doença é transmitida pela picada de flebotomíneos fêmeas infectadas, sendo os cães os principais reservatórios urbanos do parasito. O perfil clínico diversificado e o longo período de incubação são desafios para o diagnóstico da leishmaniose visceral canina (LVC). Proteínas recombinantes de Leishmania spp. têm sido estudadas como antígenos que podem aumentar a precisão de testes sorológicos. Objetivo: Avaliar o desempenho diagnóstico da proteína recombinante rLb6H, de Leishmania braziliensis, em comparação com os antígenos de referência rK39 e rK28, de L. donovani, priorizando a identificação de cães com infecção subclínica. Material e Métodos: A reatividade de anticorpos IgG séricos às proteínas recombinantes rLb6H, rK28 e rK39 foi avaliada em cães com confirmação parasitológica prévia de LVC, subdivididos de acordo com seu quadro clínico, utilizando ensaio imunoenzimático (ELISA). A precisão diagnóstica de cada ELISA foi avaliada pela análise da curva ROC (receiver operating characteristic curve). Resultados: Enquanto todos os antígenos mostraram um melhor desempenho na detecção de CVL em cães sintomáticos (SD), a detecção de CVL nos grupos oligossintomáticos (OD) e assintomáticos (AD) foi menor, mas rLb6H alcançou alta sensibilidade para CVL assintomática. Curiosamente, as amostras de CVL mais reativas a rK28 foram pouco detectadas por rLb6H, enquanto as menos reativas a rK28, principalmente do grupo AD, apresentaram maior reatividade a rLb6H. Conclusão: A proteína recombinante rLb6H mostrou utilidade na detecção de CVL assintomática, apresentando uma reatividade complementar a rK39 e rK28. Assim, estes resultados sugerem que o rLb6H pode ser incorporado em estratégias multi-antígeno para aumentar a acurácia diagnóstica da leishmaniose visceral.

Evaluation of the performance of three serological tests for diagnosis of Leishmania infantum infection in dogs using latent class analysis / Avaliação da realização de três testes sorológicos para diagnóstico de infecção por Leishmania infantum em cães utilizando análise de classe latente

Abstract Canine leishmaniasis (CanL) is a disease caused by Leishmania infantum. Serological methods are the most common diagnostic techniques used for the diagnosis of the CanL. The objective of our study was to estimate the sensitivity and specificity of one in-house ELISA kit (ELISA UNIZAR) and three commercially available serological tests (MEGACOR Diagnostik GmbH) including an immunochromatographic rapid test (FASTest LEISH®), an immunofluorescent antibody test (MegaFLUO LEISH®) and an enzyme-linked immunosorbent assay (MegaELISA LEISH®), using latent class models in a Bayesian analysis. Two hundred fifteen serum samples were included. The highest sensitivity was achieved for FASTest LEISH® (99.38%), ELISA UNIZAR (99.37%), MegaFLUO LEISH® (99.36%) followed by MegaELISA LEISH® (98.49%). The best specificity was obtained by FASTest LEISH® (98.43%), followed by ELISA UNIZAR (97.50%), whilst MegaFLUO LEISH® and MegaELISA LEISH® obtained the lower specificity (91.94% and 91.93%, respectively). The results of present study indicate that the immunochromatographic rapid test evaluated FASTest LEISH® show similar levels of sensitivity and specificity to the quantitative commercial tests. Among quantitative serological tests, sensitivity and specificity were similar considering ELISA or IFAT techniques.

Resumo A leishmaniose canina (Lcan) é uma causada pela Leishmania infantum. Os métodos sorológicos são as técnicas diagnósticas mais utilizadas para o diagnóstico da leishmaniose canina. O objetivo do nosso estudo foi estimar a sensibilidade e a especificidade de um kit ELISA interno (ELISA UNIZAR) e de três testes sorológicos disponíveis comercialmente, feitos pelo mesmo fabricante (MEGACOR Diagnostik GmbH), incluindo um teste rápido imunocromatográfico (FASTest LEISH®), um teste de anticorpos imunofluorescentes (Megafluo LEISH®) e um ensaio de imunoabsorção enzimática (Megaelisa LEISH®), utilizando-se modelos de classe latentes numa análise bayesiana. Foram incluídas duzentas e quinze amostras de soro. A maior sensibilidade foi alcançada para Fastest LEISH® (99,38%), ELISA UNIZAR (99,37%), Megafluo LEISH® (99,36%) seguida por Megaelisa LEISH® (98,49%). A melhor especificidade foi obtida por FASTest LEISH® (98,43%), seguida por ELISA UNIZAR (97,50%), enquanto Megafluo LEISH® e Megaelisa LEISH® obtiveram a menor especificidade (91,94% e 91,93%, respectivamente). Os resultados do presente estudo indicam que o teste rápido imunocromatográfico, avaliado por FASTest LEISH® mostra níveis similares de sensibilidade e especificidade aos testes comerciais quantitativos incluídos. Entre os testes sorológicos quantitativos, a sensibilidade e a especificidade foram semelhantes, considerando-se as técnicas de ELISA ou IFI.

Genetic variability of Leishmania infantum in naturally infected dogs in the state of Bahia, Brazil / Variabilidade genética de Leishmania infantum em cães naturalmente infectados no estado da Bahia, Brasil

Abstract In Brazil, Leishmania infantum mainly affects humans and dogs. The state of Bahia presents many dogs that are positive for this parasite. Despite the importance of epidemiology in this region, there are still very few studies that have assessed the genetic characteristics of L. infantum. The aim of this study is to investigate the genetic variability of L. infantum isolated identified in naturally infected dogs, in order to verify occurrence of subpopulation of this parasite in the different biomes existing in the state of Bahia. Thirty-two samples of L. infantum were analyzed, which were obtained isolated in dogs from the Mata Atlântica (rainforest), Caatinga (semi-arid scrub forest), and Cerrado (a vast tropical savannah eco-region) Bahia municipalities' biomes. All animals presented with clinical changes suggestive of Leishmania spp. and they exhibited positive reactions to serological tests. kDNA analysis with RFLP markers revealed the presence of genetic variability and gene flow in subpopulations of L. infantum; samples from the Mata Atlântica areas were genetically more similar to those from the areas of Caatinga and they were less likely to resemble those of the Cerrado. This data may be used to investigate the dissemination of parasite in the canine population of state of Bahia.

Resumo No Brasil a Leishmania infantum afeta principalmente o homem e os cães. O estado da Bahia apresenta elevado número de cães positivos por este parasito. Apesar da importância epidemiologia para a região, ainda há poucos estudos que avaliam as características genéticas de L. infantum. Objetivou-se com este estudo investigar a variabilidade genética de cepas de L. infantum identificadas em cães naturalmente infectados, a fim de verificar a ocorrência de sobpopulações do parasito nos diferentes biomas existentes no estado da Bahia. Foram analisadas 32 amostras de L. infantum isoladas em cães de municípios baianos distribuídos nos biomas Mata Atlântica, Caatinga e Cerrado. Todos os animais apresentavam alterações clínicas sugestivas de Leishmania spp. e reação positiva em exames sorológicos. A análise do kDNA com marcadores RFLP revelaram a presença de variabilidade genética e fluxo gênico nas subpopulações de L. infantum sendo que as amostras das áreas de Mata Atlântica foram geneticamente mais semelhantes as das áreas de Caatinga e foram mais distantes daquelas oriundas do Cerrado. Estas informações podem auxiliar em investigações de dispersão do parasito na população canino do Estado da Bahia.

Pathology of dogs in Campo Grande, MS, Brazil naturally co-infected with Leishmania infantum and Ehrlichia canis / Patologia de cães naturalmente coinfectados por Leishmania infantum e Ehrlichia canis em Campo Grande, MS, Brasil

Different parasites that commonly occur concomitantly can influence one another, sometimes with unpredictable effects. We evaluated pathological aspects of dogs naturally co-infected with Leishmania infantum and Ehrlichia canis. The health status of the dogs was investigated based on histopathological, hematological and biochemical analyses of 21 animals infected solely with L. infantum and 22 dogs co- infected with L. infantum and E. canis. The skin of both groups showed chronic, predominantly lymphohistioplasmacytic inflammatory reaction. The plasmacytosis in the lymphoid tissues was likely related with the hypergammaglobulinemia detected in all the dogs. The disorganization of extracellular matrix found in the reticular dermis of the inguinal region and ear, characterized by the substitution of thick collagen fibers for thin fibers, was attributed to the degree of inflammatory reaction, irrespective of the presence of parasites. In addition, the histopathological analysis revealed that twice as many dogs in the co-infected group presented Leishmania amastigotes in the ear skin than those infected solely with Leishmania, increasing the possibility of becoming infected through sand fly vectors. Our findings highlight the fact that the health of dogs infected concomitantly with L. infantum and E. canis is severely compromised due to their high levels of total plasma protein, globulins, alkaline phosphatase and creatine kinase, and severe anemia.

A infecção simultânea por parasitas de diferentes espécies pode resultar em alterações imprevisíveis. O presente estudo avaliou a patologia de cães naturalmente coinfectados por Leishmania infantum e Ehrlichia canis. A saúde dos cães foi investigada pelas análises histopatológicas, hematológicas e bioquímicas de 21 cães infectados somente por L. infantum e 22 cães coinfectados por L. infantum e E. canis. Observou-se uma reação inflamatória crônica, predominantemente linfohistioplasmocítica, na pele dos dois grupos. A plasmocitose, encontrada nos tecidos linfóides, provavelmente estava relacionada com a hipergamaglobulinemia observada em todos os cães amostrados. A desorganização da matriz extracelular da derme da região inguinal e da orelha, demonstrada pela substituição das fibras de colágeno espessas por fibras finas, foi relacionada com o grau de reação inflamatória, independente da presença de parasitas. Ainda, observamos duas vezes mais animais do grupo coinfectado apresentando formas amastigotas na pele de orelha pela histopatologia comparado ao número de cães infectados apenas por Leishmania, tornando-os desta forma mais infectivos aos vetores. Nossos resultados ressaltam que a saúde de cães coinfectados estava severamente comprometida devido aos altos níveis de proteína plasmática total, globulinas, fosfatase alcalina, creatina quinase e anemia acentuada.

Complement activation-related pseudoallergy in dogs following intravenous administration of a liposomal formulation of meglumine antimoniate / Pseudoalergia relacionada à ativação do complemento em cães após administração intravenosa de uma formulação lipossomal de antimoniato de meglumina

The increasing use of nanotechnologies in advanced therapies has allowed the observation of specific adverse reactions related to nanostructures. The toxicity of a novel liposome formulation of meglumine antimoniate in dogs with visceral leishmaniasis after single dose has been investigated. Groups of 12 animals received by the intravenous route a single dose of liposomal meglumine antimoniate (group I [GI], 6.5 mg Sb/kg), empty liposomes (GII) or isotonic saline (GIII). Evaluation of hematological and biochemical parameters showed no significant changes 4 days after administration. No undesired effects were registered in the GIII. However, adverse reactions were observed in 67.7% of dogs from both groups that received liposomal formulations. The side effects began moments after bolus administration and disappeared during the first 15 minutes after treatment. Prostation, sialorrhea and defecation were the most frequent clinical signs, registered in 33.3% and 41.6 % of animals from the groups GI and GII, respectively. Tachypnea, mydriasis, miosis, vomiting and cyanosis were also registered in both groups. The adverse reactions observed in this study were attributed to the activation of the complement system by lipid vesicles in a phenomenon known as Complement Activation-Related Pseudoallergy (CARPA). The influence of the physical-chemical characteristics of liposomal formulation in the triggering of CARPA is discussed.

O crescente uso das nanotecnologias nas terapias avançadas tem permitido a observação de reações adversas específicas relacionadas às nanoestruturas. A toxicidade de uma nova formulação lipossomal de antimoniato de meglumina após dose única foi avaliada em cães com leishmaniose visceral. Grupos de 12 animais receberam por via intravenosa uma dose única de antimoniato de meglumina lipossomal (grupo I [GI], 6,5 mg Sb/kg), lipossomas vazios (GII) ou solução salina isotônica (GIII). A avaliação de parâmetros hematológicos e bioquímicos não revelou alterações significativas quatro dias após a administração. Nenhum efeito indesejável foi registrado no GIII. No entanto, reações adversas foram observadas em 67,7% dos cães de ambos os grupos que receberam formulações lipossomais. Os efeitos colaterais iniciaram momentos após a administração em "bolus" e desapareceram no decurso dos primeiros 15 minutos após o tratamento. Prostração, sialorréia e defecação foram os sinais clínicos mais frequentes, registrados em 33,3% e 41,6% dos animais dos grupos GI e GII, respectivamente. Taquipnéia, midríase, miose, vômitos e cianose também foram registrados em ambos os grupos. As reações adversas observadas neste trabalho foram atribuídas à ativação do sistema complemento pelas vesículas lipídicas em fenômeno conhecido como Pseudoalergia Relacionada à Ativação do Complemento (PARAC). A influência das características físico-químicas da formulação lipossomal no desencadeamento de PARAC é abordada.