Seroprevalence and risk factors associated with bovine leukemia virus (BLV) seropositivity in cattle herds from Ecuador / Seroprevalencia y factores de riesgo asociados a la seropositividad al virus de la leucemia bovina (BLV) en explotaciones de producción bovina en Ecuador / Seroprevalência e fatores de risco associados à soropositividade do vírus da leucemia bovina (BLV) em rebanhos bovinos do Equador

Abstract Background: Bovine leukemia virus (BLV) is the causative agent of enzootic bovine leukosis (EBL). This disease mainly affects cattle, causing severe economic losses to producers. Objective: To establish individual and herd seroprevalence and determine the risk factors associated with BLV seropositivity for dairy and dual-purpose cattle herds in Ecuador. Methods: A total of 2,668 serum samples from 386 herds were collected. A questionnaire, including variables related to cattle health, management and the environment was completed by each herd. A commercial blocking enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) test was used to determine seropositivity. A generalized estimating equation model (GEE) was developed to determine the factors associated with BLV seropositivity. Results: Individual seroprevalence of BLV infection in Ecuador was 17.3% (CI95% = 15.86-18.74%). Herd prevalence was 37.8% (CI95% = 33.0-42.6%), and intra-herd prevalence ranged between 12.5 and 100% (median: 37.5%). The risk factors associated with BLV seropositivity were artificial insemination (OR: 2,215; CI95% =1.402-3.501), concrete floors (OR: 2.178; CI95% = 1.217-3.889), presence of wild ruminants (OR: 2.998; CI95% = 1.788-5.027), and sampling season (wet; OR: 1.996; CI95% = 1.140-3.497). Conclusions: Results indicate that BLV is widespread in cattle herds in Ecuador. In addition, the study suggests that a control program to fight BLV infection should focus on controlling the risk factors identified.

Resumen Antecedentes: El virus de la leucosis bovina (BLV) es el principal agente etiológico causante de la leucosis enzoótica bovina (EBL). Esta enfermedad afecta a los bovinos causando grandes pérdidas económicas a los productores. Objetivo: Establecer la seroprevalencia y dispersión del BLV, así como los factores de riesgo asociados a la seropositividad en explotaciones lecheras y de doble propósito en Ecuador. Métodos: Se recolectó un total de 2.668 muestras de suero de 386 explotaciones. Se aplicó un cuestionario que incluyó variables relacionadas con la salud del hato, medidas de manejo, y características ambientales de cada explotación. Para los análisis serológicos se utilizó un test inmunológico ligado a enzimas (ELISA). Para definir los factores de riesgo asociados a la seropositividad a BLV se desarrolló un modelo utilizando ecuaciones de estimación generalizadas (GEE). Resultados: La seroprevalencia de BLV en Ecuador fue de 17,3% (IC95% = 15,86-18,74%). La dispersión fue de 37,8% (IC95%= 33,0-42,6%), y la prevalencia intra-hato alcanzó rangos entre 12,5-100% (media: 37,5%). Los factores de riesgo asociados a la seropositividad a BLV fueron: inseminación artificial (OR: 2,215; IC95% = 1,402-3,501), piso de concreto (OR: 2,178; IC95% = 1,217-3,889), presencia de rumiantes salvajes (OR: 2,998; IC95% = 1,788-5,027), y temporada de muestreo (húmeda; OR: 1,996; IC95% = 1,140-3,497). Conclusiones: Los resultados indican que el BLV se encuentra disperso en las explotaciones de Ecuador. Adicionalmente, se sugiere la implementación de un programa de control para la lucha contra el BLV, debiéndose considerar medidas que se enfoquen al control de los factores de riesgo identificados en esta investigación.

Resumo Antecedentes: O vírus da leucemia bovina (BLV) é o principal agente causador da leucose enzoótica bovina (EBL). Esta doença afeta o gado causando graves prejuízos econômicos aos produtores. Objetivo: Estabelecer a soroprevalência e dispersão do BLV, assim como os fatores de risco associados à soropositividade nas produções leiteiras e de duplo propósito no Equador. Métodos: Um total de 2.668 amostras de soro de 386 explorações foram coletadas. Foi aplicado um questionário que incluía variáveis relacionadas à saúde do rebanho, medidas de manejo e ambiente para cada exploração. Para a análise sorológica foi utilizado um teste imunológico sobre enzimas (ELISA) para determinação da soropositividade. Para definir os fatores de risco associados à soropositividade a BLV, foi utilizado um modelo de equações estimativas generalizadas (GEE). Resultados: A soroprevalência de BLVno Equador é de 17,3% (IC95% = 15,86-18,74%). La dispersão de 37,8% (IC95% = 33,0-42,6%), e a prevalência intra-rebanho alcançou entre 12,5-100% (media: 37,5%). Os fatores de risco associados à soropositividade a BLV foram inseminação artificial (OR: 2,215; IC95% = 1,402-3,501), chão de concreto (OR: 2,178; IC95% = 1,217-3,889), presença de ruminantes selvagens (OR: 2,998; IC95% = 1,788-5,027) e época da amostragem (úmida; OR: 1,996; IC95% = 1,140-3,497). Conclusões: Os resultados indicam que o BLV se encontra disseminado nas explorações no Equador. Adicionalmente, o estudo pode contribuir para a implementação de um programa de controle para a luta contra o BLV, devendo-se considerar ações de controle dos fatores de risco identificados nesta investigação.

Indirect ELISA (iELISA) standardization for the diagnosis of bovine enzootic leukosis / Padronização de um ELISA indireto (iELISA) para diagnóstico da leucose enzoótica bovina

Enzootic bovine leukosis (EBL) is an infectious disease caused by bovine leukemia virus (BLV) that affects cattle worldwide. Agar gel immunodiffusion (AGID) was the reference test for EBL diagnosis for many years, but enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) showed higher sensitivity, was faster to perform, and resulted in an objective reading. However, the importation of ELISA kits is lengthy and expensive, and currently, no AGID kits are available in Brazil. The aim of this work was to standardize an indirect ELISA (iELISA) for EBL diagnosis using BLV antigens produced in Tadarida brasiliensis lung (Tb1Lu) cells, which are Bovine viral diarrhea virus (BVDV) free, unlike fetal lamb kidney (FLK) cells, currently used for this purpose. Following standardization, iELISA results were compared with those obtained by AGID and the commercial Chekit Leucose-Serum ELISA. Compared to AGID, iELISA had 94,44% sensitivity, 75.68% specificity, 79.10% positive predictive value (PPV) and 93.30% negative predictive value (NPV), with 84% concordance and a Kappa index of 0.699. Compared to the Chekit Leucose-Serum ELISA, iELISA showed 92.60% sensitivity, 87.09% specificity, 90.27% PPV and 90,00% NPV, with 90.27% concordance and a Kappa index of 0.801. Taking into account the high agreement with the traditional tests and the absence of non-specific reactions with BVDV, the developed assay could be used as diagnostic method to control EBL in Brazil.(AU)

A leucose enzoótica bovina (LEB) é uma doença infecciosa natural dos bovinos com distribuição mundial causada pelo "bovine leukemia virus" (BLV). A imunodifusão em gel de ágar (IDGA) foi considerada por muitos anos o teste de eleição, porém ensaios imunoenzimáticos (ELISA) apresentam sensibilidade mais elevada e leitura mais rápida e objetiva. No entanto, a importação de kits de ELISA é um processo dispendioso e demorado, e atualmente não há kits de IDGA comercialmente disponíveis no Brasil. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi padronizar um ELISA indireto (iELISA) para diagnóstico da LEB utilizando antígenos produzidos a partir do cultivo do BLV em linhagem celular Tadarida brasiliensis "lung" (Tb1Lu) livre de "bovine viral diarrhea virus" (BVDV), diferentemente do que acontece com as linhagens "fetal lamb kidney" (FLK) atualmente utilizadas na produção desses antígenos para uso em ensaios sorológicos. Após a padronização do iELISA, os resultados foram comparados com aqueles obtidos por IDGA e pelo ELISA comercial "Chekit Leucose-Serum". Comparado ao IDGA, o iELISA apresentou 94,44% de sensibilidade, 75,68% de especificidade, valor preditivo positivo (VPP) de 79,1% e valor preditivo negativo (VPN) de 93,3%, com concordância entre os testes de 84% e o índice Kappa 0,699. Quando comparado ao ELISA "Chekit Leucose-Serum", o iELISA apresentou sensibilidade de 92,6%, especificidade de 87,09%, VPP de 90,27% e VPN de 90%, com concordância de 90,27% e o índice Kappa 0,801. Portanto, devido à alta concordância com os testes tradicionais e ausência da ocorrência de reações inespecíficas com BVDV, o ensaio desenvolvido pode ser utilizado como ferramenta diagnóstica para o controle da LEB no Brasil.(AU)

Fibrinous pleuropneumonia caused by Pasteurella multocida associated with bovine lymphoma / Pleuropneumonia fibrinosa causada por Pasteurella multocida associada a linfoma bovino

ABSTRACT: In this work, we describe an unusual case of fibrinous pleuropneumonia caused by Pasteurella multocida associated with generalized lymphadenomegaly in a bovine. The animal had a one-month history of generalized superficial lymphadenomegaly that progressed to anorexia and submandibular oedema, resulting in spontaneous death. At necropsy, the parenchyma of the lymph nodes and multiple organs was obliterated by a dense proliferation of round neoplastic cells (lymphoma). Additionally, the neoplasm presented multifocal areas of haemorrhage and necrosis, characteristic of lymphoma. The parietal and visceral pleura and parietal pericardium were enlarged and covered diffusely with large amounts of a yellowish fibrillary material. The lungs were mildly enlarged, non-collapsed, and firm and exhibited interlobular septae that were thickened with a gelatinous material. Histopathological examination showed that the parietal and visceral pleura were enlarged due to a diffuse and severe inflammatory infiltrate composed of degenerate neutrophils associated with severe fibrin deposition, characteristic of fibrinous pleuropneumonia. Pleura and parietal pericardium fragments were cultivated in aerobic and microaerobic microbiological conditions. Round greyish colonies of gram-negative coccobacilli that were shiny and non-haemolytic were observed in sheep blood agar. The biochemical profile was indicative of Pasteurella spp. Molecular identification was performed by partial 16S rRNA amplification following sequencing. Pasteurella multocida was confirmed as the primary bacterium associated with the bovine fibrinous pleuropneumonia. We are able to infer that the lymphoma caused immunodepression, which increased the animal's susceptibility to atypical infectious microorganisms such as pathogenic P. multocida.

RESUMO: Nesse trabalho, relatamos um caso de pleuropneumonia fibrinossupurativa causada por Pasteurella multocida associada à linfoadenomegalia em um bovino. O animal apresentava aumento generalizado de linfonodos há um mês progredindo para anorexia e edema submandibular por três dias culminando com óbito. Durante a necropsia, tanto dos linfonodos quanto de diversos órgãos evidenciaram proliferação neoplásica de células arredondadas e arranjadas em mantos (linfoma). Adicionalmente, áreas multifocais de hemorragia e necrose, características de linfoma, foram observadas. As pleuras parietal e visceral e pericárdio parietal apresentavam-se espessas e recobertas por acentuada quantidade de fibrina. Os pulmões estavam aumentados, não colabados, firmes e exibiam espessamento com edema moderado de septos interlobulares. À microscopia, cortes da pleura visceral exibiram acentuado infiltrado inflamatório de neutrófilos degenerados com intensa deposição de fibrina, características da pleuropneumonia fibrinossupurativa, além de neovascularização e proliferação de fibroblastos. Amostras de pulmão e da pleura foram cultivadas em aerobiose e microaerobiose. Evidenciou-se o crescimento puro no ágar sangue ovino de colônias redondas, acinzentadas, brilhantes e não-hemolíticas, sendo caracterizadas como cocobacilos gram-negativos. As características bioquímicas do isolado foram condizentes com Pasteurella spp. Procedeu-se a identificação molecular do isolado através da amplificação parcial do gene rRNA 16S com posterior sequenciamento do produto amplificado. Deste modo foi possível a confirmação do isolado como Pasteurella multocida, sendo o agente primário da pleuropneumonia fibrinosa. Com estes dados, podemos afirmar que o linfoma causou um quadro de imunodepressão, a qual aumenta a susceptibilidade dos animais a agentes infecciosos atípicos, como a P. multocida patogênica.

Classificação de 86 casos de linfoma em bovinos de acordo com a Working Formulation (WF) of Non-Hodgkin's Lymphomas for Clinical Usage e a Revised European-American Classification of Lymphoid Neoplasms (REAL) / Classification of 86 bovine lymphomas cases according to the Working Formulation (WF) of Non-Hodgkin's Lymphomas for Clinical Usage and The Revised European-American Classification of Lymphoid Neoplasms (REAL)

Por meio de um estudo retrospectivo, realizou-se avaliação fenotípica (histologia) e imunofenotípica (imuno-histoquímica [IHQ]) de 86 casos de linfoma bovino. Quanto ao padrão de distribuição, todos os linfomas foram incluídos como difusos. Em relação à dimensão dos linfócitos neoplásicos, 83,8% dos linfomas foram considerados como de grandes células e 11,6% como de pequenas células. Linfomas mistos, ou seja, constituídos por grandes e pequenas células, representaram apenas 4,6% dos casos. Quanto ao número de mitoses, 84,9% dos linfomas foram incluídos como de grau intermediário, 10,5% como de baixo grau e 4,6% como de alto grau. No que se refere à morfologia do núcleo, linfomas em que predominavam linfócitos não clivados (58,2%) ou linfócitos clivados (37,2%) foram mais frequentes do que aqueles em que havia uma mistura igualmente proporcional de linfócitos clivados e não clivados (4,6%). Com base nestes resultados, os 86 linfomas foram assim distribuídos utilizando-se a classificação proposta pela Working Formulation (WF) of Non-Hodgkin's Lymphomas for Clinical Usage: difuso de grandes células não clivadas (46,5%), difuso de grandes células clivadas (33,7%), difuso de pequenas e grandes células (4,6%), difuso de pequenas células - tipo plasmocitoide (7%), imunoblástico (3,5%), difuso de pequenas células - tipo intermediário (2,3%), difuso de pequenas células não clivadas (1,2%) e difuso de pequenas células não clivadas - tipo Burkitt (1,2%). Na imuno-histoquímica, 27 dos 86 (31,4%) linfomas foram positivos para o anticorpo monoclonal CD79αcy, utilizado para detecção de linfócitos B, e nenhum caso foi positivo para o anticorpo policlonal CD3, utilizado para detecção de linfócitos T. Com base nestes resultados, os 27 linfomas B foram assim distribuídos utilizando-se a Revised European-American Classification of Lymphoid Neoplasms (REAL): linfoma difuso de grandes células B (81,5%), linfomas imunoblásticos de grandes células (11,1%) e linfomas...

A retrospective study of 86 cases of bovine lymphoma classified as with diffuse pattern of distribution and verified by phenotypic (histology) and immunophenotypic (immunohistochemistry [IHC]) is presented. Regarding the size of the neoplastic lymphocytes, 83.8% was classified as large cells lymphoma and 11.6% as small cells lymphoma. Mixed lymphomas, i.e., formed by large and small cells simultaneously represented only 4.6% of all cases. Regarding their mitotic index, 84.9% of lymphomas was included in the intermediate-grade, 10.5% as low-grade and 4.6% as high-grade. Regarding the nucleus morphology, lymphomas with mostly non-cleaved cells (58.2%) or cleaved cells (37.2%) were the more frequent than those with a balanced mixed proportion of cleaved and non-cleaved cells (4.6%). Based on these results, the 86 lymphoma cases were classified by the Working Formulation (WF) of Non-Hodgkin's Lymphomas for Clinical Usage as: diffuse large non-cleaved cell (46.5%), diffuse large cleaved cell (33.7%), diffuse mixed small and large cell (4.6%), diffuse small cell - plasmacytoid (7%), immunoblastic (3.5%), diffuse small cell - intermediate (2.3%), diffuse small non-cleaved cell (1.2%), and diffuse small non-cleaved cell Burkitt's (1.2%). According to the IHC, 27 out of 86 (31.4%) lymphomas were positive to monoclonal antibody CD79αcy, used to detect B cells, and none were positive for polyclonal antibody CD3, used to detect T cells. Based on this, the 27 B-cell type lymphomas were distributed as follows: diffuse large B-cell lymphoma (81.5%), large cell immunoblastic lymphoma (11.1%), and lymphoplasmacytoid lymphoma...

Aspectos epidemiológicos, clínicos e anatomopatológicos do linfoma em bovinos: 128 casos (1965-2013) / Epidemiological, clinical and pathological aspects of lymphoma in cattle: 128 cases (1965-2013)

Por meio de um estudo retrospectivo, os aspectos epidemiológicos, clínicos e anatomopatológicos de 128 casos de linfoma bovino são descritos. Dos protocolos que informavam o sexo (n=111), 84,7% correspondiam a fêmeas e 15,3% a machos. Dos protocolos em que constava a raça (n=108), a mais prevalente foi a holandesa (63%). Em relação à idade (n=107), houve uma variação entre um e 14 anos. A maioria dos bovinos era adulta (89,7%) e a maior concentração dos casos ocorreu ao redor de 5-8 anos (57,9%). Em relação aos sinais clínicos (n=89), linfadenomegalia foi o achado mais frequentemente observado (74,1%). Outros sinais clínicos, principalmente aqueles relacionados com os sistemas respiratório (dispneia, estertoração pulmonar e taquipneia), cardiovascular (taquicardia, edema subcutâneo e pulso venoso positivo), digestório (atonia ruminal, timpanismo e diarreia) e nervoso (paresia dos membros pélvicos e andar cambaleante), foram pouco prevalentes. Na necropsia (n=125), 71,2% dos bovinos apresentavam aumento de volume dos linfonodos; essa linfadenomegalia foi classificada como localizada em 89,6% dos casos e generalizada em 10,3% dos casos. Dos protocolos que informavam os linfonodos acometidos (n=58), a distribuição foi a seguinte: mesentéricos (51,7%), mediastínicos (37,9%), pré-escapulares (29,3%), ilíacos internos (27,6%), inguinais superficiais (25,8%) e traqueobrônquicos (18,9%). Além dos linfonodos, outros órgãos comumente afetados pelo linfoma neste estudo incluíram: coração (40%), fígado (15,2%), rim (14,4%), abomaso (12,8%), útero (11,2%), intestino (10,4%) e pulmão (7,2%)...

The epidemiological, clinical and pathological aspects of 128 cases of bovine lymphoma are described in this study. Out of the cases were the gender was informed (n=111), 84.7% of affected animals were females and 15.3% were males. Out of the cases were breed was informed (n=108), 63% of affected animals were Holstein cows. The age of affected cows (n=107) varied from 1 to 14 years (57.9%), with most animals being adults (89.7%) with 5 to 8 years of age (57.9%). The most common clinical sign (n=89) was lymphadenomegaly (74.1%). Other clinical signs associated with the respiratory system (dyspnea, pulmonary stridor, and tachypnea), cardiovascular system (tachycardia, subcutaneous edema, and positive venous pulse), digestive system (ruminal atony, bloat, and diarrhea), and nervous system (pelvic limb paresis and staggering pace) were less prevalent. Gross findings (n=125) included enlargement of lymph nodes in 71.2% of the cases; this finding was classified as localized in 89.6% of the cases and generalized in 10.3% of the cases. Out of the cases where the affected lymph nodes were identified (n=58) the distribution of the lymphadenomegaly was the following: mesenteric (51.7%), mediastinal (37.9%), prescapular (29.3%), internal iliac (27.6%), superficial inguinal (25.8%), and tracheobronchial (18.9%). Other commonly affected organs included heart (40%), liver (15.2%), kidney (14.4%), abomasum (12.8%), uterus (11.2%), intestine (10.4%), and lung (7.2%)...

Metabolismo oxidativo de leucócitos em animais infectados pelo Vírus da Leucemia Bovina / Oxidative burst of leukocytes from bovine leukemia Virus-Infected Cattle

A infecção pelo vírus da leucemia bovina (VLB) leva ao desenvolvimento de linfocitose persistente (LP) ou linfossarcomas, principalmente em rebanhos bovinos leiteiros. Entretanto, os eventos que induzem tais manifestações ou o efeito da infecção na função das diferentes populações de leucócitos são pouco conhecidos. Avaliou-se o efeito da infecção pelo VLB na produção intracelular de peróxido de hidrogênio (H2O2) em leucócitos circulantes, mensurada pela fluorescência produzida pela diclorodihidrofluoresceína, utilizando-se de citometria de fluxo. As células foram obtidas de cinco vacas soronegativas; cinco vacas infectadas pelo VLB, alinfocitóticas; e cinco vacas infectadas, manifestando LP. Verificou-se que a infecção pelo VLB não altera a porcentagem de leucócitos circulantes produzindo H2O2, com ou sem prévio estímulo por adição in vitro: de 12-miristato 13-acetato de forbol (PMA); de lipopolissacarídeos de Escherichia coli (LPS); ou Staphylococcus aureus. Todavia, a produção de H2O2 em leucócitos de animais apresentando LP, com ou sem estímulo, foi menor que aquela verificada em leucócitos de animais soronegativos e de animais soropositivos alinfocitóticos. Os estímulos aumentaram a porcentagem de leucócitos produzindo H2O2 e a produção intracelular média em animais soronegativos ou naqueles infectados alinfocitóticos. Contudo, em leucócitos de vacas soropositivas manifestando LP, a fagocitose de S. aureus não elevou a porcentagem de leucócitos produzindo H2O2. Também, apenas a adição de PMA elevou a produção intracelular de H2O2 em leucócitos de fêmeas soropositivas manifestando LP. Concluiu-se que bovinos infectados pelo VLB, manifestando LP, apresentam menor produção intracelular de H2O2, demonstrando vulnerabilidade funcional refletida por imunossupressão.

Widespread Bovine Leukemia Virus (BLV) infection leads to persistent lymphocytosis (PL) or lymphosarcoma, mainly in dairy herds. Nevertheless, neither the sequence of events that conducts to these symptoms, nor the effect of infection on function of different leukocyte populations, is well known. We evaluated the effect of BLV infection on immune response of cows through the analysis of hydrogen peroxide (H2O2) intracellular production of circulating leukocytes after in vitro stimuli with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), Escherichia coli lipopolysaccharides (LPS), or Staphylococcus aureus. Cells were obtained from five BLV-non infected cows, five BLV-infected, non-lymphocytotic cows, and five BLV-infected cows with PL, and analyzed by flow cytometry. Intracellular production of H2O2 was measured by dichlorodihydrofluorescein diacetate dependent fluorescence. Results showed that BLV infection does not alter the percentage of H2O2-producing circulating leukocytes (H2O2-PCL), with or without previous stimuli. However, the average of H2O2 intracellular production, with or without previous stimuli, in leukocytes obtained from cows with PL was smaller than those from cells obtained from BLV-negative cows and from BLV-infected, non-lymphocytotic cows. Moreover, stimuli increased H2O2 intracellular production and the percentage of H2O2-PCL obtained from BLVnegative cows and from BLV-infected, non-lymphocytotic cows. Conversely, neither phagocytosis of S. aureus and stimulus with LPS increases H2O2 intracellular production, nor phagocytosis increases the percentage of H2O2-PCL, when leukocytes were obtained from cows with PL. Thus, results show that BLV-infected cattle, with PL, have an impaired H2O2 intracellular production, demonstrating functional vulnerability reflected by immunosuppression.

Proliferação de linfócitos e apoptose de células CD5+ de bovinos infectados pelo vírus da leucose enzoótica bovina / Apoptosis of CD5+ cells and lymphocyte proliferation in bovine leukemia virus-infected dairy cows

Avaliaram-se a proliferação de linfócitos e a apoptose de células CD5+ de bovinos naturalmente infectados pelo vírus da leucose enzoótica bovina. Para tal, 100 vacas da raça Holandesa, em lactação, foram triadas quanto ao sorodiagnóstico para a leucose enzoótica bovina e o perfil hematológico, e 15 foram escolhidos e distribuídos uniformemente entre os três grupos, a saber: animais negativos, animais positivos alinfocitóticos e animais positivos e que manifestaram linfocitose persistente (LP). Para a avaliação da proliferação de linfócitos, procedeu-se ao isolamento das células mononucleares por gradiente de centrifugação, em que 2x10(6) linfócitos por mL foram plaqueados por poço e analisados por citometria de fluxo utilizando-se o fluorocromo CFSE-DA. A apoptose do sangue periférico deu-se utilizando a anexina V-FITC, e para a identificação das células CD5+, utilizaram-se anticorpos monoclonais. Ocorreu menor proliferação de linfócitos nos animais infectados e que manifestavam LP, e menor apoptose de células CD5+ do sangue periférico. Pode-se sugerir que o desenvolvimento da LP, resultante do aumento de linfócitos B, deve-se à redução do processo apoptótico das células CD5+, principal população infectada, e que a maior proliferação linfocitária pode se restringir apenas ao estádio inicial do desenvolvimento da LP.

The purpose of the present trail was to evaluate the lymphocyte proliferation and the apoptosis rates of CD5+ cells in dairy cows infected with bovine leukemia virus (BLV) with distinct lymphocyte profiles in infected animals known as alymphocytotic (AL) and persistent lymphocytosis (PL). A total of 100 Holstein cows were sera tested for bovine leukemia virus through agar gel immunodiffusion (AGID) and enzyme-linked immunosorbent-assay (ELISA). From these animals, 15 cows were selected and divided uniformly in 3 groups (negative, AL, LP). The lymphocyte proliferation was performed using flow cytometric measurement of CFSE-DA dye, where 2x10(6)/mL lymphocytes were plated per well. The apoptosis of CD5+ cells from peripheral blood was performed using the annexin V-FITC to measure the apoptosis rates and the identification of CD5+ was accessed using monoclonal antibodies. Animals from the LP group showed lower lymphocyte proliferation and also lower apoptosis rates of CD5+ cells compared with negative and AL animals. The development of PL which resulted from an increase in B cell count, is due to the decrease in the apoptosis rates of CD5+ cells, and the higher lymphocyte proliferation appears to be limited only in the initial stages of development of LP.

Avaliação funcional de monócitos de bovinos naturalmente infectados pelo vírus da leucose bovina / Functional evaluation of monocytes in cattle naturally infected with the bovine leucosis virus

Para a avaliação funcional de monócitos de bovinos infectados pelo vírus da leucose enzoótica bovina (LEB), foram coletadas amostras de sangue de 10 vacas com sorodiagnóstico negativo (SN), 10 com sorodiagnóstico positivo e que manifestavam linfocitose persistente (LP), e 10 com sorodiagnóstico positivo alinfocitóticas (AL). Os monócitos foram separados por gradiente de densidade e aderência em placa, submetidos aos testes de viabilidade por exclusão do azul de tripan, fagocitose de partículas de Zymosan, espraiamento em lamínula de vidro e quantificação da liberação de peróxido de hidrogênio (H2O2) e de óxido nítrico (ON). Monócitos de animais com LP apresentaram os menores índices de viabilidade (P<0,001), de fagocitose (P<0,001) e de espraiamento (P=0,006). Também apresentaram maior produção de H2O2 sem prévio estímulo (P=0,001) e após estímulo in vitro com 12-miristato 13-acetato de forbol (P=0,006) do que monócitos de animais SN e AL. O aumento da produção de H2O2 proporcionado pelo estímulo foi menor (P=0,015) nos monócitos de fêmeas que manifestaram LP. Não houve diferença na produção de ON pelos monócitos segundo os grupos. Os resultados indicam que o vírus da LEB, apesar de infectar linfócitos B, altera funcionalmente os monócitos circulantes em bovinos que manifestam LP.

Assuming that the bovine leukosis virus (BLV) alters quantitatively and qualitatively bovine circulating leukocyte subpopulations, thus influencing the innate immune response, monocytes function in BLV-infected cattle was assessed. Peripheral blood was obtained from 10 BLV-negative cows (SN), 10 naturally BLV-infected, non-lymphocytotic cows (AL), and 10 BLV-infected cows with persistent lymphocytosis (PL). Monocytes were isolated by density gradient and adherence to plates. Cells were submitted to Trypan Blue dye exclusion viability assay, phagocytosis of Zymosan and cell-spreading assays, and quantification of hydrogen peroxide (H2O2) and nitric oxide (NO) production. Monocytes from cattle with PL had the lowest viability (P<0.001), phagocytosis of Zymosan particles (P<0.001), and spreading (P=0.006) rates. Additionally, monocytes from cows with PL had the highest production of H2O2 , with no prior stimulus (P=0.001), and after in vitro stimulus with phorbol 12-myristate 13-acetate (P=0.006). Nonetheless, the boost in H 2 O 2 production, provided by in vitro stimulus, observed in monocytes from cows with PL was lower (P=0.015) than that observed in monocytes from SN and AL cattle. There was no difference in NO production among groups. Results show that BLV, despite infecting B lymphocytes, alters innate immune functions of monocytes isolated from BLV-infected cows expressing PL.

Influência da leucose enzoótica bovina na função fagocítica de leucócitos circulantes em animais manifestando linfocitose persistente / Influence of enzootic bovine leukosis on phagocytic function of circulating leukocytes from animals with persistent lymphocytosis

Avaliou-se, por citometria de fluxo, a fagocitose de Staphylococcus aureus conjugados com iodeto de propídio (IP), por leucócitos circulantes obtidos de cinco fêmeas bovinas negativas no sorodiagnóstico para a Leucose Enzoótica Bovina (LEB); de cinco fêmeas infectadas, manifestando linfocitose persistente (LP); e de cinco fêmeas infectadas, porém alinfocitóticas. Observou-se que, entre as amostras dos animais soronegativos, a porcentagem média de células realizando fagocitose (12,90%) não diferiu da observada entre as células dos animais alinfocitóticos (14,70%). Contudo, ambas foram maiores (p=0,047) que aquela verificada entre as células obtidas de animais manifestando LP (7,20%). Além disso, a intensidade média de fagocitose (caracterizada pela intensidade de fluorescência do IP, em valores arbitrários), verificada em leucócitos de animais manifestando LP (17,43) foi menor (p<0,001) que a observada em leucócitos de animais alinfocitóticos (29,50), e que a observada em leucócitos de animais soronegativos (25,18), que não diferiram entre si. Assim, os resultados permitem-nos alvitrar que há alteração na função fagocítica de leucócitos circulantes em animais infectados pelo vírus da LEB, manifestando LP.

This study evaluated the phagocytosis of propidium iodide-labeled Staphylococcus aureus (PI-Sa) by circulating leukocytes obtained from five Enzootic Bovine Leukosis (EBL)-negative cows, five naturally EBL-infected, non-lymphocytotic cows, and five EBL-positive cows with persistent lymphocytosis (PL), analyzed by flow cytometry. Among cells obtained from EBL-infected cows, presenting PL, the percentage of leukocytes carrying out phagocytosis (7.20%), was smaller (p=0.047) than that verified among cells obtained from non-infected (12.90%), and from BLV-infected, non-lymphocytotic cows (14.70%). Furthermore, leukocytes obtained from EBL-infected cows, presenting PL, showed smaller phagocytosis intensity (characterized by the intensity of propidium iodide fluorescence) than leukocytes obtained from non-infected and from EBL-infected, non-lymphocytotic, cows (p<0.001). Therefore, results show a decreased phagocytic function among circulating leukocytes obtained from BLV-infected, lymphocytotic cows.