Caracterização da via de ativação de neurotoxicidade induzida pela Anidroegconina Metil Éster (AEME) in vitro / Activation pathways characterization related to the Anhydroegconin Methyl Ester (AEME)-induced neurotoxicity in vitro

O consumo mundial de cocaína vem crescendo e no Brasil já são estimados mais de 2 milhões de usuários, destes 370 mil usam regularmente o crack. A cocaína, em suas diversas formas, é um psicoestimulante com alto potencial de abuso e a forma fumada causa à seus usuários mais complicações de saúde do que as demais formas. Muitas dessas complicações estão relacionadas às funções cognitivas, como comprometimento da atenção e memória. O usuário de crack, no ato de fumar, está sujeito tanto à ação da cocaína volatilizada quanto a dos seus produtos de pirólise, principalmente da anidroecgnonina metil éster (AEME). Considerando que pouco se conhece a respeito da AEME, ou de sua associação com cocaína, que os distúrbios cognitivos podem estar relacionados à morte neuronal e que o hipocampo é uma das principais estruturas encefálicas relacionada com cognição e memória, este trabalho visou investigar as vias de ativação de morte celular decorrente das exposições à 1 mM de AEME, 2 mM de cocaína, bem como da associação de ambas (C + A), por 3, 6 e 12 h. Para tanto, utilizamos neurônios hipocampais de embriões de rato no 18º dia embrionário (E18) que foram mantidos em cultura por até 7 dias (DIV7), quando foram feitas as exposições. Nossos resultados mostraram que em 3 h a cocaína e a AEME promoveram aumento de atividade enzimática (pelo teste de MTT) que se reverteu ao longo de 12 h. Além disso, AEME aumentou na permeabilidade da membrana plasmática em 6 h que se manteve em 12 h. Embora essas alterações tenham ocorrido em 3 h e 6 h, caspase-8 se ativou apenas em 12 h, ativando também a sinalização apoptótica com a externalização de FS. A cocaína ativou o processo autofágico a partir de 3 h aumentando a quantificação de LC3 II, mas apresentou redução de células com vesículas ácidas em 6 h e 12 h, sugerindo que esta promova morte neuronal por causar falha no fluxo autofágico. A AEME apresentou somente aumento de células com vesículas ácidas em 3 h, revertendo-se já em 6 h, indicando que o processo autofágico só se fez presente no primeiro horário, dando vez à programação de apoptose celular, por ativação da via extrínseca. A associação dessas substâncias apresentou-se mais neurotóxica do que as substâncias isoladas, com redução de células íntegras a partir de 3 h de exposição, ativação de caspase-8 e externalização de FS em 6 h, sem envolver o sistema autofágico. Além disso, as características morfológicas observadas em 6 h, como o aumento do tamanho do núcleo e do corpo celular que se tornaram picnóticos em 12 h, podem sugerir que a neurotoxicidade induzida por C + A seja por necroptose, onde a ativação de caspases resulta em um processo tipo necrótico. Assim, concluímos que, embora a literatura mostre morte neuronal por apoptose a partir de 24 h de exposição para cocaína e para AEME, as respostas celulares que levam à este fim iniciam-se já em 12 h, por ativação da via extrínseca e a associação destas substâncias é ainda mais neurotóxica, iniciando a sinalização de morte já em 6 h e induzindo uma morfologia tipo necrótica

Cocaine market is increasing all around the world. In Brazil it is estimated that almost 2 million people make usage of this substance which 370 thousand people use the crack form. Cocaine is a psychostimulant with large potential for abuse and the smokable form produces more health problems than the other routes of use, mainly in the cognitive field related to compromising attention, memory and decision take. The crack users are exposed to both volatized cocaine and their pyrolysis products, which the main product is the anhydroecgonine methyl ester (AEME). Considering that the cognitive disturbs could be related to neurons death, the memory functions are also related to the hippocampal functions, and little is known about the AEME neurotoxicity or even the combination of cocaine and AEME in cell fate, our study aims to characterize the time and pathways related to the hippocampal neurotoxicity induced by 2 mM of cocaine, 1 mM of AEME and the association (C + A) of both substances during 3 h, 6 h and 12 h of exposure. Our results showed that cocaine and AEME increased enzymatic activity (MTT test) in 3 h but it reversed during 12 h of exposure. Moreover, AEME increased cell permeability in 6 h keeping it until 12 h. Although theses early alterations, both substances activated caspase -8 after 12 h when early apoptosis was also observed by the FS externalization. Cocaine activated the autophagic process at 3 h increasing the LC3 II quantification, but decreased the number of cell with acid vesicle at 6 h and 12 h, suggesting neuronal death due to failure in the autophagic flux. AEME showed increased in cell number with acid vesicle only in 3 h which returned after 6 h suggesting that the autophagic process gave place to the apoptotic program starting from the extrinsic pathway. The association of cocaine and AEME was shown more neurotoxic than them alone, decreasing the number of integral cells after 3 h, activating caspase -8 and promoting FS externalization after 6 h without involving the autophagy. In addition, taking the C + A morphology in 6 h, where it was observed increasing of nucleus and soma size that became pyknotic at 12 h, we suggest that the neuronal death could occur by necroptosis because this composition activated caspase -8 and resulted in necrotic like morphology. Thus, we conclude that cocaine- and AEME-induced apoptosis neuronal death starts in 12 h of exposure by the extrinsic pathway and the association of both substances is more neurotoxic than they alone, starting earlier after 6 h and resulting in a necrotic-like morphology

Envolvimento da metilecgonidina, produto de pirólise da cocaína, na farmacodependência / Involvement of methylecgonidine, a cocaine pyrolysis product, in addiction

O crack é a forma fumada de administração da cocaína com o maior potencial para causar dependência. Até 80% da sua fumaça consiste no produto de pirólise da cocaína, a metilecgonidina (AEME). Apesar do vasto conhecimento acerca dos efeitos e prejuízos causados pela cocaína, nenhum trabalho avaliou os efeitos da AEME na farmacodependência, objetivo deste trabalho. Ratos adultos machos Wistar foram expostos à salina, à AEME 3 mg/kg, à cocaína 15 mg/kg e a associação entre cocaína e AEME, intraperitonealmente, em duas situações: 1) exposição prolongada (administração todos os dias, por 9 dias); 2) sensibilização comportamental dependente de contexto (administração em dias alternados, por 5 dias e 7 dias de abstinência, seguido do desafio). A dose de AEME foi definida pela avaliação da atividade locomotora em teste agudo. A AEME foi capaz de aumentar a atividade locomotora após exposição prolongada e potencializar a expressão da sensibilização comportamental dependente de contexto induzida pela cocaína. A concentração de dopamina e seus metabólitos aumentaram no caudado-putâmen em todos os grupos, sendo observado um sinergismo entre cocaína e AEME no grupo da associação. No núcleo accumbens, foi observado aumento de dopamina apenas nos grupos cocaína e associação. Paralelamente, houve aumento da relação p-CREB/CREB 60 minutos após a administração aguda de AEME 3 mg/kg e cocaína 15 mg/kg, tanto no caudado-putâmen quanto no núcleo accumbens, assim como nos grupos cocaína e associação após a sensibilização comportamental dependente de contexto. Com a finalidade de determinar o mecanismo de ação da AEME, foi realizado um estudo farmacológico detalhado dessa substância em células CHO-K1 de rato expressando heterologamente os receptores colinérgicos muscarínicos subtipos 1 a 5, uma vez que estudos anteriores sugeriram uma interação entre a AEME e os receptores colinérgicos muscarínicos. O ensaio de competição com [3H]NMS mostrou uma pequena preferência da AEME para o subtipo M2. Estudos funcionais (mobilização de cálcio) revelaram um efeito agonista parcial da AEME para os subtipos M1 e M3 e antagonista para os demais subtipos, dando suporte à hipótese colinérgica de ação da AEME. Nossos resultados indicam que a AEME isoladamente não foi capaz de causar sensibilização, mas potencializou a ação da cocaína quando coadministrada. O efeito antagonista da AEME em receptores subtipo M2 e M4 no caudado-putâmen, e M4 e M5 no núcleo accumbens causaram aumento de dopamina nessas regiões encefálicas, onde a atividade colinérgica medeia sua liberação

Crack cocaine is the smoked form of cocaine with the highest potential for addiction. Up to 80% of crack smoke consists of cocaines pyrolysis product anhydroecgonine methyl ester (AEME). Despite of many studies regarding cocaine effects and its hazardousness, few reports have assessed AEME's role in addiction, the aim of this study. Adult male Wistar rats were i.p. dosed with either saline, 3 mg/kg AEME, cocaine 15 mg/kg, or cocaine-AEME combination in two situations: 1) prolonged exposure (drugs administered every day for 9 days); 2) behavioral sensitization context specific (drugs administered in alternating days for 5 days, followed by 7-days abstinence period and a challenge injection). AEME dose was chosen based on locomotor activity after an acute test. AEME increased locomotor activity in the prolonged exposure and it potentiated cocaine-induced behavioral sensitization. Dopamine level and its metabolites were elevated in the caudate-putamen in all non-saline groups with a synergic effect between cocaine and AEME in the cocaine-AEME group. In the nucleus accumbens, dopamine was elevated only in cocaine and cocaine-AEME groups. At the same time, p-CREB/CREB ratio, increased 60 minutes after an acute administration of 3 mg/kg AEME and 15 mg/kg cocaine in both caudate-putamen and nucleus accumbens, the same result observed in both cocaine and cocaine-AEME groups after behavioral sensitization. Once previous studies suggested AEME interacts with muscarinic acetylcholine receptors, a detailed pharmacological analysis of AEME at rat muscarinic acetylcholine receptors subtypes 1-5 heterologously expressed in CHO-K1 cells was performed to determine a mechanism for the novel effects of AEME. [3H]NMS competition binding showed a slight preference for M2 subtype; functional studies (Ca2+ mobilization) revealed partial agonist effects at M1 and M3 and antagonist effects at the remaining subtypes, supporting the cholinergic hypothesis of AEME's effects. Our results indicate AEME alone does not elicit behavior sensitization but significantly potentiates cocaine sensitization when co-administered. AEME antagonism effects at M2 and M4 muscarinic acetylcholine receptors subtypes in the caudate-putamen, and M4 and M5 muscarinic acetylcholine receptors subtypes in the nucleus accumbens resulted in dopamine increase in these brain regions, where its release is mediated by cholinergic activity