Genetic similarities and phylogenetic analysis of Muntjac (Muntiacus spp. ) by comparing the nucleotide sequence of 16S rRNA and cytochrome B genome / Semelhanças genéticas e análise filogenética de muntjac (Muntiacus spp. ) comparando a sequência de nucleótidos de rRNA 16S e genoma citocromo B

This study aimed to identify the phylogenetic similarities among the muntjac (Muntiacus spp.). The phylogenetic similarities among seven major muntjac species were studied by comparing the nucleotide sequence of 16s rRNA and cytochrome b genome. Nucleotide sequences, retrieved from NCBI databases were aligned by using DNASTAR software. A phylogenetic tree was created for the selected species of muntjac by using the maximum likelihood method on MEGA7 software. The results of nucleotide sequences (16s rRNA) showed phylogenetic similarities between, the M. truongsonensis and M. rooseveltorum had the highest (99.2%) while the lowest similarities (96.8%) found between M. crinifrons and M. putaoensi. While the results of nucleotide sequences (Cty b) showed the highest similarity (100%) between M. muntjak and M. truongsonensis and the lowest s (91.5%) among M. putaoensis and M. crinifrons. The phylogenetic tree of muntjac species (16s rRNA gene) shows the main two clusters, the one including M. putaoensis, M. truongsonensis, M. rooseveltorum, and M. muntjak, and the second one including M. crinifrons and M. vuquangensis. The M. reevesi exists separately in the phylogenetic tree. The phylogenetic tree of muntjac species using cytochrome b genes shows that the M. muntjak and M. truongsonensis are clustered in the same group.

Este estudo visou identificar as semelhanças filogenéticas entre os muntjac (Muntiacus spp.). As semelhanças filogenéticas entre sete grandes espécies muntjac foram estudadas comparando a sequência de nucleótidos de 16s rRNA e genoma citocromo b. As sequências de nucleótidos, obtidas a partir de bases de dados NCBI, foram alinhadas utilizando o software DNASTAR. Foi criada uma árvore filogenética para as espécies selecionadas de muntjac utilizando o método de probabilidade máxima no software MEGA7. Os resultados das sequências de nucleótidos (16s rRNA) mostraram semelhanças filogenéticas entre o M. truongsonensis e o M. rooseveltorum tiveram o maior número (99,2%) enquanto as semelhanças mais baixas (96,8%) encontradas entre M. crinifrons e M. putaoensi. Enquanto os resultados das sequências de nucleótidos (Cty-b) apresentaram a maior semelhança (100%) entre M. muntjak e M. truongsonensis e os mais baixos (91,5%) entre M. putaoensis e M. crinifrons. A árvore filogenética das espécies muntjac (gene rRNA 16s) mostra os dois principais aglomerados, o que inclui M. putaoensis, M. truongsonensis, M. rooseveltorum e M. muntjak, e o segundo incluindo M. crinifrons e M. vuquangensis. O M. reevesi existe separadamente na árvore filogenética. A árvore filogenética das espécies muntjac usando genes citocromo b mostra que os M. muntjak e M. truongsonensis estão agrupados no mesmo grupo.

Estimación del tiempo límite de detección del gen citocromo b de humanos en hembras de Lutzomyia evansi / Estimation of time detection limit for human cytochrome b in females of Lutzomyia evansi

Resumen Introducción. Las técnicas de biología molecular han permitido ampliar el conocimiento sobre las fuentes de ingestión de sangre de los insectos vectores. Sin embargo, la utilidad de estas técnicas depende de la cantidad de sangre ingerida y del proceso de digestión en el insecto. Objetivo. Determinar el tiempo límite de detección del gen citocromo b (Cyt b) de humanos en hembras de Lutzomyia evansi alimentadas experimentalmente. Materiales y métodos. Se evaluaron ocho grupos de hembras de L. evansi alimentadas con sangre humana, las cuales fueron sacrificadas en intervalos de 24 horas desde el momento de la ingestión sanguínea. Se extrajo el ADN total de cada hembra y se amplificó un segmento de 358 pb del gen Cyt b. Los productos amplificados fueron sometidos a un análisis de polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP), con el fin de descartar falsos positivos. Resultados. El segmento del gen Cyt b de humanos fue detectado en 86 % (49/57) de las hembras de L. evansi a partir de las 0 horas y hasta 168 horas después de la ingestión de sangre. En 7 % (4/57) de los individuos se amplificó el ADN del insecto y en el 7 % restante no se amplificó la banda de interés. No se encontraron diferencias estadísticas en cuanto a la amplificación del segmento del gen Cyt b de humanos ni al número de muestras amplificadas entre los grupos de hembras sacrificadas a distintas horas después de la ingestión. Conclusión. El segmento del gen Cyt b de humanos fue detectable en hembras de L. evansi hasta 168 horas después de la ingestión de sangre.

Abstract Introduction: Molecular biology techniques have allowed a better knowledge of sources of blood meals in vector insects. However, the usefulness of these techniques depends on both the quantity of ingested blood and the digestion process in the insect. Objective: To identify the time limit for detection of the human cytochrome b (Cyt b) gene in experimentally fed females of Lutzomyia evansi. Materials and methods: Eight groups of L. evansi females were fed on human blood and sacrificed at intervals of 24 hours post-ingestion. Total DNA was extracted from each female and a segment of 358 bp of Cyt b was amplified. In order to eliminate false positives, amplification products were subjected to a restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis. Results: The human Cyt b gene segment was detected in 86% (49/57) of the females of L. evansi, from 0 to 168 hours after blood ingestion. In 7% (4/57) of the individuals we amplified insect DNA, while in the remaining 7%, the band of interest was not amplified. We did not find any statistical differences between groups of females sacrificed at different times post-blood meal regarding the amplification of the human Cyt b gene segment or the number of samples amplified. Conclusion: The human Cyt b gene segment was detectable in L. evansi females up to 168 hours after blood ingestion.

Diagnostic Cytochrome b gene profiles for the identification of paca (Cuniculus paca) bushmeat: implications for the monitoring of illegal hunting and wildlife trade / Perfis diagnósticos do gene Citocromo b para a identificação molecular de paca (Cuniculus paca): implicações para a detecção e monitoramento de caça e comércio ilegal

Abstract Paca (Cuniculus paca Linnaeus, 1766) is the second largest rodent found in Brazil. The quality of the meat and a long tradition of hunting have contributed to the decline of the natural populations of this species. Hunting of paca is strictly prohibited in Brazil, but in spite of this restriction, no forensic tools are available for the identification of the meat. We describe an efficient method, based on single nucleotide polymorphisms of the cytochrome b gene, that can be used to differentiate biological material derived from paca from those of domestic species commonly used as sources of meat. The identification of the presence of C. paca in the samples was 100% reliable.

Resumo Paca (Cuniculus paca Linnaeus, 1766) é o segundo maior roedor brasileiro. A qualidade da carne e a forte tradição da caça de subsistência são fatores que contribuem significativamente para o declínio das populações. Apesar da proibição a caça no Brasil, no momento ainda não há ferramentas disponíveis para identificar a carne e seus produtos como prova forense. Neste trabalho propomos um método eficaz de identificação, baseado em polimorfismos de único nucleotídeo no gene Citocromo b, objetivando diferenciar material biológico de paca das espécies domésticas comumente utilizadas como alimento no Brasil. A identificação das amostras de paca foram possíveis em 100% das amostras analisadas.

PCR em tempo real para caracterização de fontes alimentares de flebotomíneos (Diptera: Psychodidae) / Real-time PCR for the characterization of feeding sources of sand flies (Diptera: Psychodidae)

Os flebotomíneos são insetos hematófagos de grande importância médica e veterinária atuando como vetores de parasitas como Leishmania. O estudo do padrão alimentar desses vetores pode ajudar a compreender a sua interação com potenciais reservatórios de Leishmania. Neste estudo, desenvolvemos ensaios de PCR em tempo real para identificação de sangue em flebotomíneos. Seis pares de primers foram desenhados com base no gene citocromo b de sequencias disponíveis no GenBank dos seguintes hospedeiros potenciais: cão, gato, cavalo, galinha, rato e humano. Primeiramente, os ensaios de PCR em tempo real utilizando SYBR Green foram conduzidos usando uma curva padrão com oito concentrações diferentes (i.e., 10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 100 fg, 10 fg e 1 fg por 2 µl) de amostras do DNA extraído do sangue com EDTA a partir de cada espécie de animal. Em seguida, o DNA foi extraído de 100 fêmeas de flebotomíneos ingurgitadas de campo pertencentes a três espécies (i.e., Lutzomyia longipalpis, L. migonei e L. lenti) foram testadas pelos protocolos aqui padronizados. Fêmeas de flebotomíneos foram experimentalmente alimentadas em um rato (Rattus rattus) e utilizadas para avaliar a detecção do ensaio. Os protocolos funcionaram de forma eficiente com limites de detecção de 10 pg a 100 fg. Fêmeas de flebotomíneos ingurgitadas coletadas no campo estavam alimentadas de humanos...

Natural Leishmania sp. reservoirs and phlebotomine sandfly food source identification in Ibitipoca State Park, Minas Gerais, Brazil

Leishmania spp are distributed throughout the world and different species are associated with varying degrees of disease severity. However, leishmaniasis is thought to be confined to areas of the world where its insect vectors, sandflies, are present. Phlebotomine sandflies obtain blood meals from a variety of wild and domestic animals and sometimes from humans. These vectors transmit Leishmania spp, the aetiological agent of leishmaniasis. Identification of sandfly blood meals has generally been performed using serological methods, although a few studies have used molecular procedures in artificially fed insects. In this study, cytochrome b gene (cytB) polymerase chain reaction (PCR) was performed in DNA samples isolated from 38 engorged Psychodopygus lloydi and the expected 359 bp fragment was identified from all of the samples. The amplified product was digested using restriction enzymes and analysed for restriction fragment length polymorphisms (RFLPs). We identified food sources for 23 females; 34.8% yielded a primate-specific banding profile and 26.1% and 39.1% showed banding patterns specific to birds or mixed restriction profiles (rodent/marsupial, human/bird, rodent/marsupial/human), respectively. The food sources of 15 flies could not be identified. Two female P. lloydi were determined to be infected by Leishmania using internal transcribed spacer 1 and heat shock protein 70 kDa PCR-RFLP. The two female sandflies, both of which fed on rodents/marsupials, were further characterised as infected with Leishmania (Viannia) braziliensis. These results constitute an important step towards applying methodologies based on cytB amplification as a tool for identifying the food sources of female sandflies.

Diversidade genética e filogeografia molecular de Euphractus sexcinctus e Dasypus novemcinctus (Mammalia: Xenarthra) através de ADN mitocondrial (citocromo b) / Genetic diversity and molecular phylogeography of Euphractus sexcinctus and Dasypus novemcinctus (Mammalia: xenarthra) through the mitochondrial DNA (Cytocrome b)

Para este estudo foi sequenciado o gene mitocondrial Citocromo b (1140pb) em amostras de ADN de 12 exemplares de Euphractus sexcinctus e 67 exemplares de Dasypus novemcinctus. Análises filogenéticas (distância, máxima parcimônia e máxima vesossimilhança) e populacionais (median-joining) foram realizadas com objetivo de estudar a variação genética e a filogeografica destas duas espécies. Também foi avaliada a posição filogenética de outros Dasypodidae (Dasypus kappleri, Cabassous unicinctus, C. tatouay e Tolypeutes tricinctus). Os resultados confirmaram a monofilia de Dasypodidae, Dasypodinae, Euphractinae e Tolypeutinae, assim como a relação maior entre as duas últimas sub-famílias. Em E. sexcinctus foram identificados 11 haplótipos e em D. novemcinctus 49. As análises mostraram o alto polimorfismo do gene Citocromo b, a falta de estruturação genética das populações, uma baixa divergência genética (distância p) entre os haplótipos e mostraram que o Rio São Francisco não constitui uma barreira ao fluxo gênico nestas duas espécies, uma vez que o mesmo haplótipo ocorreu em suas duas margens. Três haplótipos de E. sexcinctus formaram em todas as análises um grupo que se distribui na região da Caatinga do extremo nordeste do Brasil, ao norte do Rio São Francisco. As análises mostraram quatro grupos entre os haplótipos de D. novemcinctus (49 deste estudo e 26 do Genbank), com uma clara separação entre o haplótipo norte-americano de todos os demais sul-americanos. Entre os sul-americanos existem três grupos, um formado por 65 haplótipos que se distribuem no Brasil, Argentina e Paraguai. Os outros dois grupos são menores, um ocorrendo na região Norte do Brasil (Amazonas e Pará) com três haplótipos e outro formado por seis haplótipos que ocorrem na Bahia, Rio de Janeiro e Rondônia. Embora suas características morfológicas sejam compatíveis com as descrições de D. novemcinctus, exemplares destes dois últimos grupos mostraram diferenças morfológicas em seus crânios...

DNA samples of 12 specimens of Euphractus sexcinctus and 67 specimens of Dasypys novemcinctus had the mitochondrial gene Cytochrome b (1140pb) amplified and sequenced. Phylogenetic (distance, maximum parsimony and maximum likelihood) and population (median-joining) analyses were carried out in order to study the genetic variation and phylogeography of these two species. It was also assessed the phylogenetic position of other Dasypodidae: Dasypus kappleri, Cabassous unicinctus, C. tatouay and Tolypeutes tricinctus. The results confirmed the monophyly of Dasypodidae, Dasypodinae, Euphractinae and Tolypeutinae, as well as the relationship between the two largest sub-families. In E. sexcinctus 11 haplotypes and in D. novemcinctus 49, were identified. The analyses showed the high polymorphism of the gene Cytochrome b, a lack of population genetic structure, a low genetic divergence (p distance) between haplotypes and that Rio São Francisco is not a barrier to gene flow in these two species, once the same haplotype occur in both margins. Three haplotypes of E. sexcinctus formed, in all analyses, a group that is distributed in the region of Caatinga, the extreme northeastern Brazil, north of Rio São Francisco. Analyses were congruent in showing four groups among D. novemcinctus haplotypes (49 of this study and 26 of Genbank), with a clear separation between United States haplotype and all other South American ones. Among South American haplotypes there are three groups, one is formed by 65 haplotypes distributed in Brazil, Argentina and Paraguay. The other two groups are smaller, one occurring in northern Brazil (Para and Amazonas) with three haplotypes, and another formed by six haplotypes occurring in Bahia, Rio de Janeiro and Rondônia. Although morphologic characteristics are compatible with the descriptions of D. novemcinctus, the latter two groups showed some morphologic differentiation in their skulls that corroborate molecular data and suggest...

Genetic diversity of Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae) in Chuquisaca, Bolivia based on the mitochondrial cytochrome b gene

Partial cytochrome b DNA sequences for 62 Triatoma infestans were analyzed to determine the degree of genetic variation present in populations of this insect in the northwest region of Chuquisaca, Bolivia. A total of seven haplotypes were detected in the localities sampled. The phylogenetic relationship and population genetic structure of the haplotypes found in this region, indicate that there is greater variation in this relatively small region of Bolivia than what has been previously reported by studies using the same gene fragment, for more distant geographic areas of this country. In addition, a comparison of rural and peri-urban localities, indicate that there is no difference in the genetic variation of T. infestans between these two environments.