First molecular detection of Haemoproteus spp. and Plasmodium spp. in eared doves (Zenaida auriculata) in Brazil / Primeira detecção molecular de Haemoproteus spp. e Plasmodium spp. em pombos (Zenaida auriculata) no Brasil

Abstract The aim of this study was to verify the presence and identify the species of haemosporidian parasites in eared doves (Zenaida auriculata) in Brazil. Two hundred and eleven male and female eared doves were trap-captured in four different regions of Londrina city, in southern Brazil. Whole blood was collected in EDTA tubes through heart puncture after euthanasia in a CO2 chamber. A nested PCR targeting the mitochondrial cytochrome b gene (cyt b) of Haemoproteus spp./Plasmodium spp. was performed, followed by an enzymatic digestion to identify the genus. Phylogenetic trees were constructed to determine the closely related species. Out of 211 eared doves, 209 (99.05%) were positive for Haemoproteus spp. and/or Plasmodium spp. RFLP analysis showed that 72.72% (152/209) of eared doves were positive only for Haemoproteus spp., 6.22% (13/209) were positive only for Plasmodium spp., and 21.05% (44/209) of eared doves had mixed infections. Genetic analysis found four samples that were homologous with Haemoproteus multipigmentatus and one that was homologous with Plasmodium sp. This is the first molecular study of hemoparasites from eared doves in Brazil, and it is also the first description of H. multipigmentatus and Plasmodium spp. infection in eared doves in Brazil.

Resumo O objetivo deste estudo foi verificar a presença e a identificação espécies de parasitas hemosporídeos em pombos (Zenaida auriculata) no Brasil. Duzentos e onze pombos machos e fêmeas foram capturados em quatro regiões diferentes de Londrina, sul do Brasil. Amostra de sangue foi coletada em tubos contendo EDTA por meio de punção cardíaca, após eutanásia em câmara de CO2. Uma nested PCR com alvo no gene mitocondrial citocromo b (cyt b) de Haemoproteus spp./Plasmodium spp. foi realizada, seguida de digestão enzimática para identificar o gênero. A árvore filogenética foi construída para determinar a relação com outras espécies. Das 211 pombas, 209 (99,05%) foram positivas para Haemoproteus spp./Plasmodium spp. A análise RFLP demonstrou que 72,72% (152/209) das pombas foram positivas somente para Haemoproteus spp.; 6,22% (13/209) foram positivas somente para Plasmodium e 21,05% (44/209) das pombas tiveram infecções mistas. A análise genética mostrou quatro amostras homólogas com H. multipigmentatus e uma com Plasmodium spp. Este é o primeiro estudo molecular de hemoparasitas em pombos no Brasil. E é também a primeira descrição da infecção por H. multipigmentatus e Plasmodium spp. em pombos Z. auriculata no Brasil.

Serological and molecular techniques applied for identification of Plasmodium spp. in blood samples from nonhuman primates / Técnicas sorológicas e moleculares aplicadas na identificação de Plasmodium spp. em amostras de primatas não humanos

Abstract The aim of this study was to identify Plasmodium spp. in blood samples from nonhuman primates (NHPs) in the state of Maranhão, using classical and alternative techniques for examination of human malaria. A total of 161 blood samples from NHPs were analyzed: 141 from captive animals at a Wildlife Screening Center (CETAS) and 20 from free-living animals in a private reserve. The techniques used were microscopy, rapid diagnostic test (RDT), Indirect fluorescent antibody test (IFAT) and molecular techniques (semi-nested PCR, quantitative real-time PCR and LAMP). Two serological methods (dot-ELISA and indirect ELISA) were also standardized with rhoptry protein-soluble antigen of P. falciparum and P. berghei. Trophozoite forms of Plasmodium sp. were identified on slides from five different animals. No samples were positive through RDT and LAMP. Four samples were seropositive for P. malariae through IFAT. The samples showed low reactivity to ELISA. Plasmodium sp. was detected in 34.16% (55/161) of the samples using qPCR based on the 18S rRNA gene. After sequencing, two samples showed 100% identityl to P. malariae, one showed 97% identity to Plasmodium sp. ZOOBH and one showed 99% identity to P. falciparum . PCR was shown to be the most sensitive technique for diagnosing Plasmodium in NHP samples.

Resumo Neste estudo objetivamos identificar Plasmodium spp. em amostras sangue de primatas não humanos (PNH) do estado do Maranhão, utilizando técnicas clássicas e alternativas para o exame da malária humana. Foram analisadas 161 amostras de sangue de PNH, sendo 141 de CETAS (cativeiro) e 20 de reserva particular (vida livre), utilizando microscopia, teste de diagnóstico rápido (RDT), imunofluorescência indireta (IFI) e técnicas moleculares (semi-nested PCR, PCR em tempo real quantitativo e LAMP). Dois métodos sorológicos (dot-ELISA e ELISA indireto) também foram padronizados com antígenos solúveis de roptrias de P. falciparum e P. berghei. Formas trofozoíticas de Plasmodium sp. foram identificadas em lâminas de cinco animais diferentes. Nenhuma amostra foi positiva em TDR e LAMP. Quatro amostras foram soropositivas para P. malariae na IFI. Os soros de PNH mostraram baixa reatividade pelo ELISA indireto. Plasmodium sp. foi detectado em 34,16% (55/161) das amostras utilizando a qPCR baseada no gene 18S rRNA. No sequenciamento, duas amostras mostraram identidade com P. malariae (100%), uma com Plasmodium sp. ZOOBH (97%) e uma com P. falciparum (99%). A PCR mostrou ser a técnica mais sensível para diagnósticos de Plasmodium em amostras de PNH.

Abordagens distintas à Interação entre Anopheles spp. e Plasmodium spp.: estabelecendo um modelo murino de laboratório, estudando o escape dos esporozoítos e a microbiota

Nas Américas, a região Amazônica é a área com o maior risco de transmissão de malária. No entanto, a falta de modelos experimentais adequados de anofelinos das Américas tem limitado o progresso para compreender a biologia de transmissão de malária nesta região. Entretanto, com colonização de vetores naturais da Amazônia, como o A. aquasalis, abriu pela primeira vez a possibilidade de estudar sua interação com o Plasmodium sp. No presente trabalho, questões básicas dessa interação foram investigadas tais como: 1) a susceptibilidade do A. aquasalis à diferentes espécies de Plasmodium sp. 2) o processo de escape dos esporozoítos dentro do vetor 3) a dinâmica microbiana do A. aquasalis em diferentes estágios de vida e fonte alimentar. Como resultados, (1) O A. aquasalis se mostrou refratário às infecções com P. falciparum (NF54 e 7G8), P. berghei e P. yoelii 17xnl, e altamente susceptível ao P. yoelii N67 tornando a utilização do P. yoelii N67/A. aquasalis um bom modelo de estudo de laboratório. (2) Nesse trabalho foi descrita a microanatomia do escape dos esporozoítos de oocistos de quatro espécies de Plasmodium: P. gallinaceum e P. berghei, e as duas espécies principais que causam a malária em humanos, P. vivax e P. falciparum. Verificou-se que os esporozoítos possuem mecanismos específicos de escape do oocisto.

O P. berghei e o P. gallinaceum têm um mecanismo comum, na qual a parede do oocisto se decompõe antes dos esporozoítos escaparem. Em contraste, os esporozoítos de P. vivax e P. falciparum possuem um mecanismo de escape ativo, através de propulsão polarizada. (3) A diversidade microbiana descrita demonstrou que as pupas possuem uma riqueza maior de fOTUs comparado aos outros grupos estudados. Foi visto que, a abundância das fOTUs de Enterobacteriaceae aumenta nos mosquitos pós infectados com P. vivax comparado aos outros grupos, sugerindo uma possível relação com o parasito. Acreditamos que com estes conhecimentos, poderemos abrir novas fronteiras para estudos de controle da malária focado no contexto epidemiológico brasileiro, como, por exemplo, produção de insetos geneticamente modificados potencialmente resistentes ao patógeno, ou mesmo indicar candidatos para estudo de vacinas de bloqueio de transmissão

O sistema imune inato na patogênese da malária

Por muitas décadas de estudo sobre a patogênese da malária, tem-se estabelecido que as manifestações clínicas são frequentemente uma consequência da inflamação sistêmica provocada pelo parasito. Os imunocomplexos (ICs) são encontrados na circulação de pacientes com inflamação, seja ela estéril ou causada por infecções. O presente trabalho demonstra que pacientes com malária apresentam elevados níveis de anticorpos circulantes anti-DNA, bem como ICs contendo DNA do parasito. A ativação de monócitos por ICs resultou na formação de specks de inflamassomas contendo NLRP3, NLRP12 ou AIM2, ativação de caspase 1 e liberação de IL-1βativa. As células monocucleares do sangue periférico estimuladas com ICs produzem grandes quantidades de IL-1βe TNFαe, no entanto, baixos níveis de IL-10.

A principalfonte de citocinas pró-inflamatórias em pacientes de fase aguda da malária é a subpopulação de monócitos CD14+, que expressa o receptor FcγRIIIA (CD16). Os monócitos de pacientes em fase de convalescência apresentam um fenótipo anti-inflamatório e, quando estimulados com ICs, produzem elevados níveis de IL-10 e baixos níveis de TNFαe IL-1β. Portanto, dependendo do status de ativação do monócito, os ICs podem estimular ou modular a produção de citocinas pró-inflamatórias, atuando como um importante imunoregulador durante a malária. Os monócitos (MOs), macrófagos e células dendríticas (DCs) são populações de células heterogêneas que têm papel crucial na reparação de tecidos, detecção de presença de microrganismos invasivos, iniciando respostas imunitárias protetoras. Estudos recentes definiram novos marcadores que permitem a distinção entre monócitos inflamatórios de células dendríticas derivadas de monócitos (MO-DCs), no entanto, a contribuição destas células para neuroinflamaçãodurante a MCE não foi avaliada

Neste trabalho, observamos que a infecção por Plasmodium berghei ANKA (PbA) promove a diferenciação de monócitos inflamatórios esplênicos e DCs convencionais por células dendríticas derivadas de monócitos (MO-DCs), que são CD11c+CD11b+F4/80+DC-SIGN+Ly6C+. Estas células respondem a IFNγ sendo a principal fonte de CXCL9 e CXCL10. Além disso, células MO-DCs expressando CXCL9/10 emergem no cérebro via CCR5 dependente, coincidindo com o influxo de células T CD8+e o desenvolvimento da síndrome neuropatológica letal. Assim, nossos dados fornecem evidências de que as MO-DCs induzidas pela infecção com PbA desempenham um papel central nas respostas imunes, mediando o desenvolvimento de MCE. De acordo com nossos resultados, após a diferenciação, MO-DCs, que expressam CXCL9 e CXCL10, tem um papel importante na ativação de células T CD4+e T CD8+no baço e também migram para o SNC dependente de CCR5, onde atraem e ativam células T CD8+, levando ao desenvolvimento de MCE

Genomic study of Anopheles (Nyssorhynchus) aquasalis, Curry 1932. A Neotropical human malaria vector

A malária humana é uma doença provocada por parasitas do gênero Plasmodium, os quais na natureza requerem de um mosquito anofelíno para completar o seu ciclo de vida e serem transmitidos a um hospedeiro humano. Nas Américas, o Brasil tem a maior incidência de malária, sendo responsável por 41% dos casos. Com o aparecimento do sequenciamento de nova geração e das ferramentas bioinformática relacionados, grandes avanços foram alcançados em relação à montagem de genomas e transcriptomas de anofelinos, assim como na exploração de estratégias de paratransgenesis para interromper a transmissão da malária. No entanto, os vetores neotropicais da malária encontram-se longe dos vetores da África e Ásia no que refere a estes conhecimentos. Este estudo é parte de um esforço contínuo para montar o genoma do Anopheles aquasalis, um vetor neotropical da malária humana, que atualmente posiciona-se como um excelente modelo de transmissão da malária no Brasil. Em paralelo ao sequenciamento do genoma, e para maximizar os dados gerados, optamos por focar em duas tarefas pontuais e viáveis: explorar a diversidade e composição do consórcio bacteriano associado ao anofelino; assim como montar e caracterizar o genoma mitocondrial desta espécie.

O sequenciamento metagenômico ̈shotgun ̈ e o programa MG-RAST foram utilizados para fazer um ̈screening ̈ das bactérias associadas à pupas de A .aquasalis criadas em laboratório. O consórcio bacteriano predito é composto por 74 gêneros contendo bactérias marinhas e bioluminescentes. No nível taxonômico de família bacteriana, identificamos 14 OTUs compartilhadas entre anofelinos americanos e africanos. Além disso, foram comparadas cinco comunidades bacterianas associadas a duas espécies de anofelinos: A. aquasalis e Anopheles gambiae. Foi identificada uma associação significativa (NPMANOVA p <0,05) entre a composição da comunidade bacteriana e o ambiente aquático (laboratório ou condições semi-naturais) nas quais cada hospedeiro anofelino foi criado. Atualmente, o entendimento da filogenia do gênero Anopheles é limitado e as informações sobre o tempo de divergência dentro da linhagem de mosquitos é escassa.

Apresentamos a sequencia de 15,393 pb correspondente ao genoma mitocondrial de A. aquasalis. Quando comparado com outros mitogenomas anofelinos relevantes, observou-se alta similaridade na composição dos genomas assim como características estruturais conservadas. Através de análises Bayesianas, reconstruímos as relações filogenéticas e estimamos a data de divergência entre 22 anofelinos e outras espécies de dípteros. Descobrimos que o mais recente ancestral entre as subfamílias Nyssorhynchus e Anopheles +Cellia existiu ~ 83 milhões anos atrás (MYA). Estimou-se que A. aquasalis divergiu do complexo do Anopheles albitarisis faz ~ 28 MYA, e faz ~ 38 MYA do Anopheles darlingi. A distribuição estreita e o peculiar nicho ecológico do A. aquasalis, além de considerar a sua adaptação a ambientes larvários com água salobra fizeram nos perguntar se a sua história evolutiva deixou uma marca na arquitetura do seu genoma, assim como sobre a estrutura da comunidade bacteriana associada a este anofelino.

Submicroscopic malaria parasite carriage: how reproducible are polymerase chain reaction-based methods?

The polymerase chain reaction (PCR)-based methods for the diagnosis of malaria infection are expected to accurately identify submicroscopic parasite carriers. Although a significant number of PCR protocols have been described, few studies have addressed the performance of PCR amplification in cases of field samples with submicroscopic malaria infection. Here, the reproducibility of two well-established PCR protocols (nested-PCR and real-time PCR for the Plasmodium 18 small subunit rRNA gene) were evaluated in a panel of 34 blood field samples from individuals that are potential reservoirs of malaria infection, but were negative for malaria by optical microscopy. Regardless of the PCR protocol, a large variation between the PCR replicates was observed, leading to alternating positive and negative results in 38% (13 out of 34) of the samples. These findings were quite different from those obtained from the microscopy-positive patients or the unexposed individuals; the diagnosis of these individuals could be confirmed based on the high reproducibility and specificity of the PCR-based protocols. The limitation of PCR amplification was restricted to the field samples with very low levels of parasitaemia because titrations of the DNA templates were able to detect < 3 parasites/µL in the blood. In conclusion, conventional PCR protocols require careful interpretation in cases of submicroscopic malaria infection, as inconsistent and false-negative results can occur.

Análisis proteómico de Plasmodium, el agente causal de la malaria / Proteomic analysis of Plasmodium, the causal agent of Malaria

Los plasmodios son protozoarios cuyo complejo ciclo de vida se lleva a cabo en dos hospederos, el vertebrado y el mosquito. La infección de los seres humanos produce la enfermedad conocida como malaria. La secuenciación del genoma de Plasmodium falciparum y el desarrollo de la proteómica han permitido un gran avance en el conocimiento de la biología de este letal parásito. La presente revisión se centra en describir los logros recientes en el estudio del proteoma de Plasmodium falciparum y algunas de las implicaciones en la búsqueda de nuevos fármacos antimaláricos, así como en la generación de vacunas para el control de la enfermedad.

Plasmodia are protozoa whose complex life cycle takes place in two different hosts, the vertebrate and the mosquito. The human infection produces the malaria disease. The genome sequence of Plasmodium falciparum and the proteomic tools have enabled a huge advance in knowledge of the biology of this parasite. This review will focus on the recent advances in proteomic studies of Plasmodium falciparum and some implications for the search of new antimalarial drugs as well as vaccines for the control of the disease.

Histone as future drug target for malaria.

Malaria continues to be a major cause of mortality and morbidity in tropical countries and affecting around 100 countries of the world. As per WHO estimates, 300-500 million are being infected and 1-3 million deaths annually due to malaria. With the emerging knowledge about genome sequence of all the three counterparts involved in the disease of malaria, the parasite Plasmodium, vector Anopheles and host Homo sapien have helped the scientists to understand interactions between them. Simultaneous advancement in technology further improves the prospects to discover new targets for vaccines and drugs. Though the malaria vaccine is still far away in this situation there is need to develop a potent and affordable drug(s). Histones are the key protein of chromatin and play an important role in DNA packaging, replication and gene expression. They also show frequent post-translation modifications. The specific combinations of these posttranslational modifications are thought to alter chromatin structure by forming epigenetic bar codes that specify either transient or heritable patterns of genome function. Chromatin regulators and upstream pathways are therefore seen as promising targets for development of therapeutic drugs.

Coadaptation and malaria control

Malaria emerges from a disequilibrium of the system 'human-plasmodium-mosquito' (HPM). If the equilibrium is maintained, malaria does not ensue and the result is asymptomatic plasmodium infection. The relationships among the components of the system involve coadaptive linkages that lead to equilibrium. A vast body of evidence supports this assumption, including the strategies involved in the relationships between plasmodium and human and mosquito immune systems, and the emergence of resistance of plasmodia to antimalarial drugs and of mosquitoes to insecticides. Coadaptive strategies for malaria control are based on the following principles: (1) the system HPM is composed of three highly complex and dynamic components, whose interplay involves coadaptive linkages that tend to maintain the equilibrium of the system; (2) human and mosquito immune systems play a central role in the coadaptive interplay with plasmodium, and hence, in the mainten-ance of the system's equilibrium; the under- or overfunction of human immune system may result in malaria and influence its severity; (3) coadaptation depends on genetic and epigenetic phenomena occurring at the interfaces of the components of the system, and may involve exchange of infectrons (genes or gene fragments) between the partners; (4) plasmodia and mosquitoes have been submitted to selective pressures, leading to adaptation, for an extremely long while and are, therefore, endowed with the capacity to circumvent both natural (immunity) and artificial (drugs, insecticides, vaccines) measures aiming at destroying them; (5) since malaria represents disequilibrium of the system HPM, its control should aim at maintaining or restoring this equilibrium; (6) the disequilibrium of integrated systems involves the disequilibrium of their components, therefore the maintenance or restoration of the system's equilibrium depend on the adoption of integrated and coordinated measures acting on all components,...

The importance of Anopheles albitarsis E and An. darlingi in human malaria transmission in Boa Vista, state of Roraima, Brazil

In several districts of Boa Vista, state of Roraima, Brazil we found Anopheles (Nyssorhynchus) albitarsis E to be the primary vector of human malaria parasites, and during 2001-2002 it was significantly more abundant than An. darlingi (p < 0.001). Other species sampled were An. (Nys.) braziliensis, An. (Ano.) peryassui, An. (Nys.) nuneztovari, An. (Nys.) oswaldoi s.l., and An. (Nys.) triannulatus. As determined by the ELISA technique An. darlingi had a higher overall infection rate (2.1 percent) compared with An. albitarsis E (1.2 percent). However, a marginally higher proportion of An. albitarsis E was infected with Plasmodium vivax compared with An. darlingi, and the An. albitarsis E biting index was also much higher. These results suggest the importance of An. albitarsis E in malaria transmission in a savannah ecoregion of northern Amazonian Brazil, and reconfirm the importance of An. darlingi even if at lower abundance.

Diagnostic microarray: an array of possibilities for parasitology

Parasites affect the majority of the world,s population. Despite this fact, trials to develop vaccines remain far-off. Scientists have studied the gene expression as a hallmark of gene activities reflecting the current cell conditions. Analyzing differentially expressed genes is a major initiative and most labs recoil at the amount of time and high costs required for obtaining results. By employing microarrays, researchers can decrease their reliance upon time-consuming techniques; consequently, microarray is beginning to dominate other molecular diagnostic technologies. Moreover, the ability of microarrays to monitor simultaneous gene expression of thousands of genes and to produce broad arrays of data has the potential to shift the resources of the scientists from data gathering to analyzing data that are already available. As microarray technology improves and its cost decreases, the role of the ability to "see" the molecular biology pathways involved in parasite host relationships will place this technology at the forefront of parasite research

The merozoite surface protein-1 (MSP-1) as a human malaria vaccine candidate: geographic patterns of allelic diversity and immune recognition

A proteína de superfície de merozoítos-1 (MSP-1) é um dos principais antígenos candidatos à vacina contra a fase assexuada sanguínea da malária. nesta revisäo analisamos dados disponíveis sobre a extensäo da diversidade da MSP-1 em populaçoes naturais de P. falciparum e P. vivax, e o potencial impacto desta diversidade sobre o reconhecimeno imunológico deste antígeno por pacientes com malária. Emfatizamos os dados recentemente obtidos durante estudos realizados na Amazônia brasileira, onde ambas as espécies de parasita säo prevalentes. Os dados moleculares e imunológicos säo discutidos em relaçäo à biologia da populaçäo de parasitas e possíveis estratégias para o desenvolvimento de uma vacina contra a malária baseada na MSP-1.

Plasmodium ovale infections detected by PCR assay in Lao PDR.

Plasmodium ovate infection was demonstrated in 5 out of 143 inhabitants in a village in Lao PDR by blood microscopy and PCR assay. Although the specimen confirmed to be positive for P. ovale by microscopical examination was only one, the target sequences in the 18S rRNA genes of malaria parasite detected in all of the five cases were consisted with those of P. ovale by the PCR assay. This is the first report concerning the presence of so many cases with P. ovale infection in Lao PDR.