Aspidosperma (Apocynaceae) plant cytotoxicity and activity towards malaria parasites. Part II: experimental studies withAspidosperma ramiflorum in vivo and in vitro

Several species of Aspidospermaplants are used to treat diseases in the tropics, including Aspidosperma ramiflorum, which acts against leishmaniasis, an activity that is experimentally confirmed. The species, known as guatambu-yellow, yellowperoba, coffee-peroba andmatiambu, grows in the Atlantic Forest of Brazil in the South to the Southeast regions. Through a guided biofractionation of A. ramiflorumextracts, the plant activity against Plasmodium falciparumwas evaluated in vitro for toxicity towards human hepatoma G2 cells, normal monkey kidney cells and nonimmortalised human monocytes isolated from peripheral blood. Six of the seven extracts tested were active at low doses (half-maximal drug inhibitory concentration < 3.8 µg/mL); the aqueous extract was inactive. Overall, the plant extracts and the purified compounds displayed low toxicity in vitro. A nonsoluble extract fraction and one purified alkaloid isositsirikine (compound 5) displayed high selectivity indexes (SI) (= 56 and 113, respectively), whereas compounds 2 and 3 were toxic (SI < 10). The structure, activity and low toxicity of isositsirikine in vitro are described here for the first time in A. ramiflorum, but only the neutral and precipitate plant fractions were tested for activity, which caused up to 53% parasitaemia inhibition of Plasmodium bergheiin mice with blood-induced malaria. This plant species is likely to be useful in the further development of an antimalarial drug, but its pharmacological evaluation is still required.

Caracterização Imunológica e Molecular da Duffy Binding Protein do Plasmodium vivax em Áreas de Transmissão de Malária da Região Amazônica e Extra-Amazônica Brasileira / Immunological and Molecular Characterization of the Duffy Binding Protein of Plasmodium vivax in areas of malaria transmission in the Amazon region and Extra-Brazilian Amazon

A Duffy binding protein de Plasmodium vivax (PvDBP) é funcionalmente importante no processo de invasão do parasito em eritrócitos humanos Duffy/DARC positivos, sendo considerada, portanto, um importante antígeno candidato à vacina. Utilizando uma proteína recombinante contendo as regiões II a IV da PvDBP em ensaios de ELISA, o presente estudo demonstrou que diferentes populações da Amazônia brasileira desenvolvem anticorpos anti-PvDBP. Nessas áreas, a prevalência e os níveis de anticorpos variaram em função do nível de exposição, sendo a frequência de respondedores maior entre indivíduos que apresentavam história de longa exposição à malária (>10 anos). Para investigar se essa resposta imune anti-PvDBP incluía anticorpos que bloqueavam a interação ligante-receptor, utilizou-se um ensaio de citoaderência in vitro onde o domínio de ligação da PvDBP (região II, DBPII) era expresso na superfície de células COS-7 transfectadas. Anticorpos bloqueadores contra diferentes variantes da DBPII foram observados em indivíduos com história de longa exposição à malária na Amazônia brasileira. Esses dados demonstraram, pela primeira vez, que indivíduos residentes em áreas de transmissão endêmica instável, como a Amazônia brasileira, desenvolvem anticorpos bloqueadores da interação DBPII-DARC.

Contudo, ainda não está claro se esta resposta de anticorpos está correlacionada à infecção assintomática de malária. Em uma segunda etapa desse trabalho, estudou-se a resposta imune a PvDBP em indivíduos expostos pela primeira vez à malária, durante um surto de transmissão autóctone de P. vivax ocorrido em Minas Gerais, área não endêmica. Nessa área do surto, a abordagem experimental foi monitorar a resposta de anticorpos anti-PvDBP nos indivíduos que se infectaram (casos, n = 15), bem como em seus parentes e/ou vizinhos que não se infectaram (não-casos, n = 18, controles da área), por um período de 12 meses. Embora apenas 20 por cento dos indivíduos que se infectaram desenvolveram anticorpos IgG anti-PvDBP, um “boosting” dessa resposta foi observada naqueles que apresentaram recaída(s) da infecção pelo P. vivax. Nenhum dos indivíduos controles da área desenvolveu anticorpos anti-PvDBP. Por meio da genotipagem do antígeno DARC foi descartada a hipótese de que os indivíduos pertencentes a este grupo (não-casos) fossem resistentes à infecção, ou seja, não apresentavam o antígeno DARC na superfície de seus eritrócitos.

Portanto, a não-infecção desses indivíduos foi atribuída, provavelmente, ao curto período em que estiveram expostos à transmissão. Dessa forma, o próximo passo desse estudo foi analisar se os indivíduos que se infectaram (casos) desenvolviam anticorpos bloqueadores da interação DBPII-DARC. Considerando que a DBPII é altamente polimórfica, DNAs de isolados do surto foram inicialmente sequenciados para identificar as variantes de DBPII circulantes. As sequências da DBPII obtidas demonstraram a presença de um único alelo de dbpII tanto nas infecções primárias, quanto nas recaídas. Assim, o ensaio funcional foi realizado com células COS-7 que expressavam duas diferentes variantes da DBPII. Nesta população, o resultado de 12 meses de acompanhamento forneceu evidências de que anticorpos bloqueadores da interação ligante-receptor apresentam uma curta duração, e parecem ser alelo-específicos, já que uma inibição da interação DBPII-DARC foi observada apenas quando uma variante de DBPII semelhante à do isolado do surto foi utilizada

Caracterização Imunológica e Molecular da Duffy Binding Protein do Plasmodium vivax em Áreas de Transmissão de Malária da Região Amazônica e Extra-Amazônica Brasileira

A Duffy binding protein de Plasmodium vivax (PvDBP) é funcionalmente importante no processo de invasão do parasito em eritrócitos humanos Duffy/DARC positivos, sendo considerada, portanto, um importante antígeno candidato à vacina. Utilizando uma proteína recombinante contendo as regiões II a IV da PvDBP em ensaios de ELISA, o presente estudo demonstrou que diferentes populações da Amazônia brasileira desenvolvem anticorpos anti-PvDBP. Nessas áreas, a prevalência e os níveis de anticorpos variaram em função do nível de exposição, sendo a frequência de respondedores maior entre indivíduos que apresentavam história de longa exposição à malária (>10 anos). Para investigar se essa resposta imune anti-PvDBP incluía anticorpos que bloqueavam a interação ligante-receptor, utilizou-se um ensaio de citoaderência in vitro onde o domínio de ligação da PvDBP (região II, DBPII) era expresso na superfície de células COS-7 transfectadas. Anticorpos bloqueadores contra diferentes variantes da DBPII foram observados em indivíduos com história de longa exposição à malária na Amazônia brasileira. Esses dados demonstraram, pela primeira vez, que indivíduos residentes em áreas de transmissão endêmica instável, como a Amazônia brasileira, desenvolvem anticorpos bloqueadores da interação DBPII-DARC.

Contudo, ainda não está claro se esta resposta de anticorpos está correlacionada à infecção assintomática de malária. Em uma segunda etapa desse trabalho, estudou-se a resposta imune a PvDBP em indivíduos expostos pela primeira vez à malária, durante um surto de transmissão autóctone de P. vivax ocorrido em Minas Gerais, área não endêmica. Nessa área do surto, a abordagem experimental foi monitorar a resposta de anticorpos anti-PvDBP nos indivíduos que se infectaram (casos, n = 15), bem como em seus parentes e/ou vizinhos que não se infectaram (não-casos, n = 18, controles da área), por um período de 12 meses. Embora apenas 20 por cento dos indivíduos que se infectaram desenvolveram anticorpos IgG anti-PvDBP, um “boosting” dessa resposta foi observada naqueles que apresentaram recaída(s) da infecção pelo P. vivax. Nenhum dos indivíduos controles da área desenvolveu anticorpos anti-PvDBP. Por meio da genotipagem do antígeno DARC foi descartada a hipótese de que os indivíduos pertencentes a este grupo (não-casos) fossem resistentes à infecção, ou seja, não apresentavam o antígeno DARC na superfície de seus eritrócitos.

Portanto, a não-infecção desses indivíduos foi atribuída, provavelmente, ao curto período em que estiveram expostos à transmissão. Dessa forma, o próximo passo desse estudo foi analisar se os indivíduos que se infectaram (casos) desenvolviam anticorpos bloqueadores da interação DBPII-DARC. Considerando que a DBPII é altamente polimórfica, DNAs de isolados do surto foram inicialmente sequenciados para identificar as variantes de DBPII circulantes. As sequências da DBPII obtidas demonstraram a presença de um único alelo de dbpII tanto nas infecções primárias, quanto nas recaídas. Assim, o ensaio funcional foi realizado com células COS-7 que expressavam duas diferentes variantes da DBPII. Nesta população, o resultado de 12 meses de acompanhamento forneceu evidências de que anticorpos bloqueadores da interação ligante-receptor apresentam uma curta duração, e parecem ser alelo-específicos, já que uma inibição da interação DBPII-DARC foi observada apenas quando uma variante de DBPII semelhante à do isolado do surto foi utilizada

Atividade parasiticida e/ou parasitostática de fibroblastos e macrofagos humanos ativados por rIFN-y e/ou rTNF-x / Parasiticides activity and/or parasitostática of fibroblasts and macrophages activated by human rIFN-y and / or rTNF-x

Estudamos o papel da degradação do triptofano pela indoleamina 2,3-dioxigenase (INDO) no controle da replicação do T. cruzzi ou T. gondii em fibroblastos e macrófagos humanos estimulados com rIFN-gama e/ou rTNF-alfa. O T. gondii foi utlizado como controle, por ser sensível à degradação do triptofano induzida pelo rIFN-gama. A estimulação de fibroblastos humanos com rIFN-gama e o rTNF-alfa inibiu consideravelmente o desenvolvimento do T. gondii, mas não influenciou o desenvolvimento do T. cruzi. O desenvolvimento do T. gondii foi triptofano dependente, enquanto que o do T. cruzi foi triptofano independente. Ao contrário dos fibroblastos parentais, os fibroblastos defectivos na via de transdução de sinal do IFN-gama (JAKI, JAK2 e STAT1alfa) não modularam o desenvolvimento intracelular de T. gondii e nem expressaram mRNA da INDO quando estimulados pelo rIFN-gama. Houve uma pequena indução de mRNA da INDO em fibroblastos parentais e mutantes (JAK2) estimulados com rTNF-alfa, que provavelmente foi estimulado através da indução da síntese de IFN-es em fibroblastos humanos. O rIFN-gama e/ou rTNF-alfa induziram expressiva atividade tripanosomicida em macrófagos humanos. A estimulação de macrófagos humanos com rIFN-gama ou rIFN-gama + rTNF-alfa, produziu uma considerável expressão do mRNA da INDO, e pouca expressão foi detectada quando as células foram estimuladas apenas com rTNF-alfa. A adição de triptofano, ou do inibidor da INDO, norharmane, à cultura de macrófagos humanos ativados com rIFN-gama e/ou rTNF-alfa, não reverteu a inibição do crescimento do parasita, mostrando que a degradação do triptofano não é um mecanismo responsável pelo efeito tripanosomicida de macrófagos humanos ativados com rIFN-gama e/ou rTNF-alfa. Os catabólitos do triptofano (ácido quinolínico, ácido quinurênico e L-quinurenina) inibiram parcialmente o desenvolvimento do T. cruzi em macrófagos humanos. A amplificação por PCR do DNA T. cLsintese de Escherichia coli ou Neurospora crassa e Saccharomyces cerevisae e a hibridização cruzada via dot blot utilizando como sondas os produtos de PCR, sugerem a possibilidade da existência da enzima triptofano sintetase em T. cruzi, o que explicaria a insensibilidade do parasita à depleção do triptofano. Alternativamente reconhecemos que mais estudos devam ser feitos para a comprovação da existência da enzima em T. cruzi.

Atividade parasiticida e/ou parasitostática de fibroblastos e macrofagos humanos ativados por rIFN-y e/ou rTNF-x

Estudamos o papel da degradação do triptofano pela indoleamina 2,3-dioxigenase (INDO) no controle da replicação do T. cruzzi ou T. gondii em fibroblastos e macrófagos humanos estimulados com rIFN-gama e/ou rTNF-alfa. O T. gondii foi utlizado como controle, por ser sensível à degradação do triptofano induzida pelo rIFN-gama. A estimulação de fibroblastos humanos com rIFN-gama e o rTNF-alfa inibiu consideravelmente o desenvolvimento do T. gondii, mas não influenciou o desenvolvimento do T. cruzi. O desenvolvimento do T. gondii foi triptofano dependente, enquanto que o do T. cruzi foi triptofano independente. Ao contrário dos fibroblastos parentais, os fibroblastos defectivos na via de transdução de sinal do IFN-gama (JAKI, JAK2 e STAT1alfa)não modularam o desenvolvimento intracelular de T. gondii e nem expressaram mRNA da INDO quando estimulados pelo rIFN-gama. Houve uma pequena indução de mRNA da INDO em fibroblastos parentais e mutantes (JAK2) estimulados com rTNF-alfa, que provavelmente foi estimulado através da indução da síntese de IFN-es em fibroblastos humanos. O rIFN-gama e/ou rTNF-alfa induziram expressiva atividade tripanosomicida em macrófagos humanos.

A estimulação de macrófagos humanos com rIFN-gama ou rIFN-gama + rTNF-alfa, produziu uma considerável expressão do mRNA da INDO, e pouca expressão foi detectada quando as células foram estimuladas apenas com rTNF-alfa. A adição de triptofano, ou do inibidor da INDO, norharmane, à cultura de macrófagos humanos ativados com rIFN-gama e/ou rTNF-alfa, não reverteu a inibição do crescimento do parasita , mostrando que a degradação do triptofano não é um mecanismo responsável pelo efeito tripanosomicida de macrófagos humanos ativados com rIFN-gama e/ou rTNF-alfa. Os catabólitos do triptofano (ácido quinolínico, ácido quinurênico e L-quinurenina)inibiram parcialmente o desenvolvimento do T. cruzi em macrófagos humanos. A amplificação por PCR do DNA T. cLsintese de Escherichia coli ou Neurospora crassa e Saccharomyces cerevisae e a hibridização cruzada via dot blot utilizando como sondas os produtos de PCR, sugerem a possibilidade da existência da enzima triptofano sintetase em T. cruzi, o que explicaria a insensibilidade do parasita à depleção do triptofano. Alternativamente reconhecemos que mais estudos devam ser feitos para a comprovação da existência da enzima em T. cruzi

Characterization of Trypanosoma cruzi strains isolated from chronic chagasic patients, Triatomines and opossums naturally infected from the state of Rio Grande do Sul, Brazil

Thrity-five Trypanosoma cruzi strains were isolated from chronic chagasic triatomines and opossums from different municipalities of the State of Rio Grande do Sul. Parasites were characterized by means of mice infectivity, enzyme electrophoresis and randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis. Twenty-nine strains were isolated from chagasic patients, 4 from triatomines (2 from Triatoma infestans and 2 from Panstrongylus megistus) and 2 from opossums Didelphis albiventris. Thirty-three T. cruzi strains were of low and 2 strains of high virulence in mice. Both virulent strains were isolated from P. megistus. Isoenzyme analysis of the strains showed 3 different zymodemes. Eleven strains islolated from chagasic patients and 2 from D. albiventris were Z2. Eighteen strains from patients and 2 from T. infestans were ZB and 2 T. cruzi strains isolated from P. megistus were Z1. RAPD profiles obtained with 4 random primers showed a high genetic heterogeneity of T. cruzi strains. Zymodeme 2 and Zb strains were the more polymorphic. A band sharing analysis of the RAPD profiles of Z2 and ZB strains using 3 primers, showed a very low percentage of shared bands, 20 per cent among 13 ZB strains and 14 per cent among 13 Z2 strains. According to the isoenzyme results, 3 T. cruzi populations were present in State of Rio Grande do Sul. Zymodeme 2 and ZB strains were found infecting man (domiciliar transmission cycle) whereas Z1 strains were found infecting the sylvatic vector P. megistus.