Genetic counseling to a DMD asymptomatic carrier: First case report in the Peruvian public healthcare system / Asesoramiento genético a una portadora asintomática de DMD: Primer caso reportado en el Sistema de Salud Pública del Perú

SUMMARY Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a rapidly progressive dystrophinopathy with X-linked inheritance. This report describes a woman with a family history of male relatives affected by DMD, as she sought out genetic counseling about her concerns related to family planning and risks of eventually having children with the disease. We proposed her to get involved in a pilot program for carrier-status diagnosis and genetic counseling. This case illustrates the importance of a genetic counseling program for diagnosis of asymptomatic carriers in neurogenetic diseases, particularly in regions with low-resource settings. We discussed successes and misunderstandings faced throughout the process, supporting policies for present and future challenges from this and similar kinds of diagnoses.

RESUMEN La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una distrofinopatía rápidamente progresiva con herencia ligada al cromosoma X. Este reporte describe el caso de una mujer con historia familiar de hermano y sobrinos con DMD, que acudió a consulta para orientación e información sobre riesgos inherentes a una eventual planificación familiar. Le propusimos participar en un programa piloto de asesoramiento genético para determinar su estado de portador o no de la variante causal de DMD en la familia. Esta primera experiencia ilustra la importancia de tener un programa de asesoramiento genético para el diagnóstico de portadores asintomáticos de enfermedades neurogenéticas en regiones con bajos recursos. Se incluyen reflexiones y comentarios sobre aspectos positivos y retos presentados durante el proceso, las políticas de apoyo presente y futuro para el afronte de los complejos problemas planteados por éste y similares diagnósticos.

Detección de mutaciones causantes de distrofia muscular de Duchenne/Becker: reacción en cadena de la polimerasa Multiplex vs. Amplificación múltiple dependiente de ligación por sondas / Detection of mutations causing Duchenne and Becker muscular dystrophies: multiplex polymerase chain reaction vs. Multiplex ligation dependent probe amplification

RESUMEN Las distrofias musculares de Duchenne/Becker son enfermedades raras que reciben poca atención en nuestro medio. El objetivo del presente estudio fue implementar la técnica de amplificación múltiple dependiente de ligación por sondas (MLPA) y demostrar que tiene ventajas sobre la técnica de reacción en cadena de la polimerasa multiplex (PCR-multiplex). Se analizaron muestras de 40 individuos con diagnóstico presuntivo de distrofia muscular de Duchenne/Becker, primero por PCR-multiplex y luego por MLPA. Con la PCR-multiplex se detectaron 15 individuos con deleciones causales y con la técnica MLPA se logró diagnosticar a 21 individuos, cuatro duplicaciones y 17 deleciones. En conclusión, la técnica MLPA logra detectar mutaciones de tipo deleción y duplicación de exones, consiguiendo un mayor número de diagnósticos moleculares por alteraciones en el gen DMD.

ABSTRACT Duchenne and Becker muscular dystrophies are rare diseases that receive limited attention in our field. The objective of this study was to implement the Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification technique (MLPA) and to demonstrate that it has advantages over the Multiplex Polymerase Chain Reaction (Multiplex PCR) technique. Samples from 40 individuals with a presumptive diagnosis of Duchenne and Becker muscular dystrophies were analyzed: first by Multiplex PCR and then by MLPA. Fifteen individuals with causal deletions were detected with Multiplex PCR, while the MLPA technique was able to diagnose 21 individuals, four duplications, and 17 deletions. In conclusion, the MLPA technique can detect mutations of the exon deletion and duplication type, yielding a larger number of molecular diagnoses due to alterations in the DMD gene.

Polimorfismo Val/Met en gen OCT1 de respuesta a metformina en muestras de Lima y Puno. Enfoque farmacogenético de la diabetes / Val/Met polymorphism in metformin response gene OCT1 in Lima and Puno samples. Pharmacogenetic approach of diabetes

Introducción: La farmacogenética tiene utilidad clínica para evaluar los efectos de los fármacos según perfil genético y aporta a la medicina poblacional y personalizada. La diabetes mellitus tipo 2 (DMT2) es una enfermedad prevalente en el Perú y el mundo. Para su tratamiento existen varios fármacos, entre ellos la metformina. La respuesta individual puede estar influenciada por el polimorfismo Val/Met en el gen octT1 y las frecuencias varían según grupo étnico. Se ha relacionado al alelo Met con una menor respuesta a la metformina. Objetivo: Evaluar la distribución del polimorfismo Val/Met en el gen OCT1 en muestras de sangre de sujetos de Lima y Puno, e inferir su impacto en la farmacogenética de la DMT2. Diseño: Estudio descriptivo, transversal. Lugar: Facultades de Farmacia y Bioquímica, Medicina, Universidad Nacional Mayor Lima, Perú; Centro de Genética y Biología Molecular, Facultad de Medicina, Universidad de San Martín de Porres, Lima, Perú. Participantes: 56 individuos de Puno y 57 de Lima-ciudad. Intervenciones: Análisis del polimorfismo Val/Met en el gen OCT1 con la técnica PCR-RFLP. Principales medidas de resultados: Frecuencias genotípicas y alélicas. Resultados: Las frecuencias de los genotipos, en general,fueron: Val/Val=85,0% y Val/Met=15,0%. La frecuencia del alelo Val, en general, fue mayor al 93%; el alelo Met, asociado con una menor respuesta a metformina, se encontró presente en Amantaní (8,3%) y Lima (9,6%), y ausente en Taquile. Conclusiones: Para el alelo Val del gen OCT1, se ha encontrado la más alta frecuencia registrada en el mundo. Respecto al alelo Met, aunque es menos frecuente, existen diferencias entre las subpoblaciones peruanas evaluadas, y ese conocimiento puede ayudar en la farmacogenética y la toma de decisiones en el tratamiento con los antidiabéticos orales como la metformina.

Introduction: Pharmacogenetics can be used in clinical analysis to assess the efficiency of drugs according to the patient’s genetic profile, and it is becoming important for population genetics and precision medicine. The type 2 diabetes mellitus (T2DM) is highly prevalent all over the world, including Peru. Among the different drugs for T2DM, metformin is used the most and patient’s response to it can be influenced by the Val/Met polymorphism of the OCT1 (SLC22) gene, where Met is associated with a lower response. The frequencies of these polymorphisms vary according to ethnic origin. Objective: To evaluate the distribution of the Val/Met polymorphism in the OCT1 gene in samples of Lima and Puno, and to assess their impact on pharmacogenetics of T2DM. Design: Descriptive, cross-sectional study. Settings: Faculties of Pharmacy and Biochemistry, and Medicine, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Peru; Centro de Genética y Biología Molecular, Facultad de Medicina, Universidad de San Martín de Porres, Lima, Peru. Participants: DNA samples of 56 non-selected subjects from Puno and 57 from Lima regions. Interventions: Analysis of the Val/Met polymorphism in OCT1 gene using the PCR-RFLP technique. Main outcome measures: Phenotypic and allelic frequencies. Results: Genotype frequencies were Val/Val=85,0% and Val/Met=15,0%. The Val allele frequency was higher than 93%, the Met allele was associated with a lower response to metformin and was present in Amantaní (8.3%) and in Lima (9.6%), and absent in Taquile. Conclusions: We found the highest Val allele frequency in the world. Regarding the Met allele, less frequent, we found differences among the Peruvian subpopulations tested, and this knowledge can help in the pharmacogenetics and decision making about oral treatment of metformin against diabetes.

Identificación de una deleción causante de tumor del estroma gastrointestinal (Gist) por el análisis de los genes KIT y PDGFRA / Identification of a causative deletion of gastrointestinal stromal tumor (gist) by the analysis of the KIT and PDGFRA genes

Optimizar la detección de mutaciones en los genes KIT y PDGFRA en una muestra de tumor del estroma gastrointestinal (GIST). Material y Métodos: Se analizó una muestra de tumor GIST fijada y embebida en parafina. Mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se amplificaron los exones 9, 11, 13 y 17 del gen KIT y los exones 12 y 18 del gen PDGFR que contienen las mutaciones causales de GIST. Se confirmó la amplificación mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%. Los fragmentos amplificados, fueron purificados y secuenciados en un analizador genético. Se detectó una sobreposición de bases propio de una deleción por lo que se tuvo que clonar los productos del exón 11 para identificar el alelo mutado. Resultados: Se determinó la presencia de una mutación patogénica en el exón 11 del gen KIT. Dicha mutación es una deleción de 15 pares de bases que genera la pérdida de 5 aminoácidos en el receptor tirosina kinasa KIT. Se encontraron polimorfismos neutrales en los exones 11 del gen KIT y en el exón 18 del gen PDGFRA. Conclusión: El análisis molecular mediante secuenciación automática, permitió identificar una mutación en el gen KIT en una muestra de tumor GIST. Esta técnica puede ser aplicada para caracterizar las mutaciones genéticas de casos peruanos de GIST y así poder establecer un tratamiento adecuado según su perfil mutacional...

Objective: To optimize the detection of mutations in the genes KIT and PDGFRA in a sample of gastrointestinal stromal tumor (GIST). Material and Methods: We analyzed a GIST tumor sample fixed and embedded in paraffin. Using the technique of the polymerase chain reaction (PCR) we amplified exons 9, 11, 13 and 17 of the KIT gene and exons 12 and 18 PDGFR gene which contain tha causal mutations of GIST. PCR amplification was confirmed by gel electrophoresis on 2% agarose. The amplified fragments were purified and cloned for subsequent sequencing. An overlap of baeses, characteristic of a deletion was detected, so we had to clone the exon 11 products to identify mutated allele. Results: We determined the presence of a pathogenic mutation in exon 11 of KIT gene. The mutation is a deletion of 15 base pairs and generates a loss of 5 amino acids in the KIT receptor tyrosine kinase. Neutral polymorphisms were also found in exon 11 of KIT gene and exon 18 of PDGFRA gene. Conclusion: Molecular analysis by automatic sequencing identified a mutation in the KIT gene in a tumor sample GIST. This technique can be applied to characterize genetic mutations Peruvian cases of GIST and thus establish adequate treatment by mutational profile...

Características genético-moleculares de los tumores estromales gastrointestinales (GIST) / Molecular and genetic features of gastrointestinal stromal tumors (GIST)

Los tumores estromales gastrointestinales (GIST) son neoplasias mesenquimales que típicamente surgen a nivel del estómago, intestino delgado, colon, y otros sitios en la cavidad abdominal y su identificación se ha incrementado por mejoras en los criterios de detección. La mayor parte de los tumores GIST son causados por mutaciones activadoras en los genes de receptores transmembranares tirosina quinasa c-KIT y receptor alpha del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRA). Las mutaciones causales de GIST se restringen solo a ciertas regiones del gen que corresponden a importantes zonas funcionales de c-KIT o PDGFRA. Se reporta que hasta 70% de casos de GIST se debe a mutaciones en el exón 11 del gen c-Kit que corresponde a la región yuxtamembrana del receptor. La región y el tipo de mutación determinan diferencialmente cómo se desarrolla la neoplasia, el pronóstico y su respuesta a inhibidores de las tirosina quinasas como el Imanatib. Por tal motivo, el genotipado de KIT y PDGFRA es importante para el diagnóstico y establecimiento de la sensibilidad a los inhibidores tirosina quinasa.

Gastrointestinal stromal tumors (GISTs) are mesenchymal neoplasms typically arising in the stomach, small intestine, colon, and other sites in the abdominal cavity and its identification has improved dramatically mainly due to better criteria in its detection. Most GISTs tumors harbor activating mutations in the tyrosine kinase receptor c-KIT or platelet derived growth factor receptor-alpha (PDGFRA). Those mutations are restricted to a few regions corresponding to important functional domains of c-KIT or PDGFRA. Upto 70% of cases are due to mutations in exon 11 of c-KIT corresponding to its juxtamembrane region of the receptor. The location and type of mutation will differentially determine the development of the disease, its prognosis and the response to inhibitors of tyrosine kinases as Imanatib. For this reason, genotyping c-KIT and PDGFRA is important for GIST diagnosis and assessment of sensitivity to tyrosine kinase inhibitors.

Implementación de la Prueba del Multiplex PCR para el Gen DMD en Pacientes con sospecha de Distrofia Muscular de Duchenne/Becker y la identificación de una deleción de los exones 48-51 / Establishment of the multiplex PCR test for the DMD gene in patients with suspicion of Duchenne/Becker muscular dystrophy and the identification of a deletion of exons 48-51

OBJETIVO: Estandarizar la prueba del Multiplex PCR para identificar las deleciones más frecuentes que incluye nueve exones: 45, 48, 19, 17, 51, 8, 12, 44 y 4 del gen DMD cuyas mutaciones producen las distrofias musculares de Duchenne y de Becker. MATERIAL Y MÉTODO: La prueba fue realizada con 9 individuos, usando DNA obtenido de sangre periférica. De ellos, incluyendo 2 hermanos, tenían diagnóstico clínico de distrofia muscular compatible con DMD. Nueve pares de primers de los exones mencionados se usaron simultáneamente en una amplificación PCR y analizados por geles de agarosa y acrilamida. Uno de los pacientes (DMD-1) tenía diagnóstico molecular de deleción del exón 45 (control positivo) y 5 controles sanos (controles negativos). RESULTADOS: Los controles normales mostraron segmentos normales del tamaño esperado de los 9 exones luego de la amplificación PCR. El paciente DMD-1, evidenció la deleción del exón 45 (control positivo). Uno de los pacientes (DMD-3) presentó una nueva deleción que incluyó los exones 48 a 51, el resultado fue replicado en su hermano (también afectado con DMD). CONCLUSIONES: Se optimizó la prueba de Multiplex-PCR del gen DMD. Esto nos permite contar con una prueba para discernir gran número de pacientes con distrofia y determinar si tienen DMD/DMB. Uno de los pacientes mostró una mutación consistente en la deleción de los exones 48 a 51 que fué corroborada en su hermano afectado con distrofia.

OBJETIVE: To establish the Multiplex PCR test to identify the most frequent mutations caused by deletions that include DMD gene exons 45, 48, 19, 17, 51, 8, 12, 44 and 4 causing Duchenne and Becker dystrophies (DMD/BMD). MATERIALS AND METHOD: The test was performed in DNA obtained from peripheral blood of 9 individuals, four of them (including 2 brothers) patients clinically diagnosed with muscular dystrophies compatible DMD. Nine pair of primers corresponding to the above mentioned exons were used simultaneously for PCR amplification and analyzed in agarose and polyacrilamide gel electrophoresis. One of the patients (DMD-1) used as positive control, had a previous molecular diagnosis with a deletion of exon 45. RESULTS: Normal controls showed the expected size for the 9 segments amplified by PCR. The study of the sample of patient DMD- 1 with previous molecular diagnosis corroborated the lack of the band corresponding to exon 45. One of the patients (DMD-3) evidenced a new deletion spanning exons 48 to 51, that mutation was also replicated in his dystrophic brother. CONCLUSIONS: We have established the Multiplex-PCR test for the DMD gene. This will enable us to have a system for the serial screening of patients suspected of Duchenne or Becker muscular dystrophy. One of the patients showed a deletion comprising exons 48 to 51, mutation corroborated in his afflicted dystrophic brother.

Variabilidad genética de la respuesta inflamatoria: I. Polimorfismo -511 C/T en el gen IL1β en diferentes subpoblaciones peruanas / Genetic variability of the inflammatory response: I. The -511 C/T IL1β polymorphism in different Peruvian subpopulations

El polimorfismo -511 citosina/timina (-511 C/T) en la región promotora del gen interleuquina 1 beta (IL1β) estα implicado en la producciσn diferencial de la citoquina y por tanto puede estar asociado a la respuesta inmuno-inflamatoria en obesidad, dislipidemias, cardiopatías, cáncer, infecciones, y el tratamiento con nutrientes y fármacos. Objetivos: Establecer la distribución de frecuencias de los genotipos y alelos del polimorfismo -511 C/T del gen IL1β en diferentes subpoblaciones peruanas. Diseño: Estudio descriptivo, observacional, transversal. Instituciones: Centro de Investigación de Bioquímica y Nutrición e Instituto de Medicina Tropical D.A. Carrión, Facultad de Medicina, UNMSM y Centro de Genética y Biología Molecular, Facultad de Medicina, USMP, Lima, Perú. Participantes: Pobladores peruanos. Intervenciones: Extracción de ADN genómico a partir de muestras sanguíneas o epitelio bucal según metodología estándar, de 168 individuos de 9 grupos subpoblacionales: 23 mestizos de Lima, 33 amazónicos (20 de Pucallpa y 13 de Amazonas) y 112 andinos (12 de Ancash, 10 de Cajamarca, 18 de Huarochirí-Lima, 25 de Puno-Taquile, 25 de Puno-Uros y 22 de Puno-Anapia). Análisis del polimorfismo -511 C/T mediante la técnica de PCR/RFLP, con primers específicos y digestión con la enzima de restricción AvaI, detectándose los fragmentos por electroforesis en geles de agarosa al 2% y tinción con bromuro de etidio. Principales medidas de resultados: Frecuencias genotípicas y alélicas del gen IL1β. Resultados: Se encontró las siguientes frecuencias genotípicas CC=0,024; CT=0,369 y TT=0,607, consistentes con el equilibrio de Hardy-Weinberg; y las frecuencias alélicas fueron alelo C=0,208 y aleloT= 0,792. La frecuencia del alelo T, considerado el mutante, fue muy alta en los Uros de Puno (0.940) y más baja en los mestizos de Lima (0.609). La comparación de las frecuencias genotípicas (TT versus CT+CC) y alélicas (T versus C) mostraron diferencias significativas (p<0,01) entre los pares Lima mestizos y las de Puno-Taquile y Puno-Uros. Existieron diferencias significativas (p<0,001) cuando se las comparó con otras poblaciones del mundo. Conclusiones: El alelo T mutante del polimorfismo -511 C/T en el gen IL1β, asociado a mayor producciσn de la citoquina, fue frecuente en las subpoblaciones estudiadas. Debido a las diferencias encontradas, es importante considerar la etnicidad en los estudios de asociaciσn y de riesgo de este gen, como factor de respuesta inflamatoria, en obesidad, dislipidemias, cardiopatías, cáncer, infecciones, y el tratamiento con nutrientes y fármacos.

The -511 citosyne/thymine (-511 C/T) polymorphism in the promoter region of human interleukin 1B (IL1β) gene is associated to differential cytokine synthesis and immuno-inflammatory response in obesity, dyslipidemias, cardiopathies, cancer, infections, other diseases, nutritional intervention and drug treatment. Objectives: To determine allelic and genotypic frequencies of -511 C/T polymorphism in the IL1β gene polymorphism in different Peruvian subpopulations. Design: Descriptive, cross-sectional study. Settings: Faculties of Human Medicine, Universidad Nacional Mayor de San Marcos and Universidad San Martin de Porres, Lima, Peru. Participants: Peruvian subjects. Interventions: Genomic DNA was extracted from 168 individuals from Lima (23 mestizos), 33 Amazonians (20 Pucallpa and 13 Amazonas) and 112 Andeans (12 Ancash, 10 Cajamarca, 18 Huarochiri-Lima, 25 Puno-Taquile, 25 Puno-Uros and 22 Puno-Anapia) according to standard methodology and amplification using PCR-RFLP technique. PCR products were digested with AvaI restriction enzyme and fragments were separated by 2% agarose gel electrophoresis and ethidium bromide stain. Main outcomes measures: Allelic and genotypic frequencies of the -511 C/T polymorphism in the IL1β gene. Results: CC=0,024, CT=0,369, and TT=0,607 genotypes frequencies were found, consistent with Hardy-Weinberg equilibrium, as well as alleles frequencies C = 0,208, and T= 0,792. The frequency of (mutant) T allele was very high in Puno-Uros (0,940) and low in Lima-mestizos (0,609). Comparison of genotypes (TT versus CT+CC) and alleles (T versus C) showed significant differences (p <0.01) between pairs Lima-mestizos and Puno-Uros and Puno-Taquile. Differences were significant (p <0.001) when compared to other world populations. Conclusions: T allele of IL1β gene -511 polymorphism related to increased production of the cytokine was frequent in these Peruvian subpopulations. Because of these differences, it is important to consider ethnicity in association studies and risk of this gene, factor of inflammatory response in obesity, dyslipidemias, cardiopathies, cancer, infections, other diseases, nutritional intervention and drug treatment.

Divergencia genética en poblaciones peruanas detectada a partir de las frecuencias haplotípicas del mtDNA y del gen nuclear MBL / Peruvian population's genetic differences detected by both mtDNA and MBL nuclear gene haplotypical frequencies

Objetivos: Avanzar en el conocimiento del origen de las poblaciones peruanas estudiadas en un contexto filogeográfico. Diseño: Estudio genético poblacional. Instituciones: Laboratorio de Genética Humana, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, e Instituto de Genética y Biología Molecular, Facultad de Medicina, Universidad San Martín de Porras, Lima, Perú. Participantes: Siete poblaciones peruanas. Metodología: Análisis comparativo de los resultados a partir del estudio del mtDNA y el gen nuclear MBL de siete poblaciones peruanas, procesados de manera separada y luego combinados, utilizando el programa PHYLYP 3.65, para obtener valores FST de diferenciación genética y la construcción de árboles de distancias por aplicación del algorritmo UPGMA y el análisis subsecuente de los agrupamientos (clusters) generados. Principales medidas de resultados: Árboles genéticos generados. Resultados: De manera separada, los árboles generados para cada marcador genético tuvieron topologías propias y diferentes entre sí. Procesados de manera combinada, el árbol resultante demostró que los mayores valores de diferenciación genética se hallaron en las Islas del Lago Titicaca (Puno, Perú) conocidas -Taquile, Amantani y Anapia-, que fue calificada como muy alta, porque mostró valores de FST de 0.3113, 0.2949 y 0.3348 respecto de las poblaciones estudiadas, tanto fuera del Departamento de Puno -como Chachapoyas, Pucallpa y Chiclayo, respectivamente-, así como a la de los Uro del mismo Puno y del mismo Lago Titicaca (0.2837). Fuera de Puno, el par de poblaciones Chachapoyas-Pucallpa fue el menos divergente, al alcanzar entre ellas un valor de FST de 0.0108, calificándosele de pequeña. Conclusiones: El árbol obtenido del procesamiento de los marcadores vía una matriz combinada demostró que las poblaciones que habitan las islas de Taquile, Amantani y Anapia, divergen notablemente de las restantes cuatro procesadas del Perú, incluyendo la más próxima a ellas dentro del mismo Lago Titicaca, como es la de los Uro. Explicar estos hallazgos será el siguiente objetivo de nuestras investigaciones, en principio, mediante la ampliación de los marcadores genéticos empleados y del número de poblaciones analizadas a nivel del Perú.

Objectives: To advance in the knowledge of Peruvian populationsÆ origin in a phylogeographical context. Design: Population genetics study. Setting: Human Genetics Laboratory, Biological Sciences Faculty, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, and Genetics and Molecular Biology Institute, Faculty of Medicine, Universidad San Martin de Porras, Lima, Peru. Participants: Seven Peruvian populations. Methods: Comparative analysis of mtDNA and MBL nuclear gene study results in seven Peruvian populations processed separately and then combined using PHYLYP 3.65 Program in order to obtain FST values of genetic differentiation; construction of distance trees by applying UPGMA algorithm and subsequent generated clustersÆ analysis. Main outcome measures: Genetic trees. Results: Trees generated for each genetic marker had proper and distinct topologies among them. Combined processing resulted in a tree with higher values of genetic differentiation in Lago Titicaca Islands (Puno, Peru) Taquile, Amantani y Anapia, graded as very high because they showed 0.3113, 0.2949 y 0.3348 FST values with respect to the populations studied outside of Puno Department -like Chachapoyas, Pucallpa and Chiclayo-, as well as those of both UroÆs in same Puno and Lago TiticacaÆs populations (0.2837). Out of Puno, the pair Chachapoyas-Pucallpa population was the least divergent with 0.0108 FST value between them, classifying as small. Conclusions: The tree obtained from markers by a combined matrix process determined that populations inhabiting in Taquile, Amantani y Anapia islands possess notable genetic divergence respect to the four remainders studied in Peru, including the UroÆs population geographically very close to them and within the same Lago Titicaca. Our next objective will be to explain these findings initially by increasing genetic markers and number of populations analyzed in Peru.

Polimorfismo -308 g/a en la región promotora del gen factor de necrosis tumoral alfa (tnfa) en diferentes subpoblaciones peruanas / The -308 g/a tumor necrosis factor alpha (tnfa) promoter polymorphism in different peruvian subpopulations

El alelo mutante A del polimorfismo -308 Guanina/Adenina (-308 G/A) del gen TNFA (citoquina Factor de Necrosis Tumoral alfa), esta implicado a una mayor producción de la proteína y asociado a la susceptibilidad a enfermedades inmunológicas, infecciosas e inflamatorias. Nuestro objetivo es establecer la distribución de frecuencias de los alelos y genotipos de este polimorfismo en diferentes subpoblaciones peruanas para evaluar su utilidad como factor de riesgo a dichas enfermedades. Se determinó los genotipos del polimorfismo -308 G/A del gen TNF alfa mediante PCR-RFLP en el DNA de 135 individuos de 7 grupos subpoblacionales: 20 mestizos de Lima; 56 nativos amazónicos (44 de Andoas-Loreto, y 12 de Amazonas); 59 nativos andinos (12 de Ancash , 10 de Cajamarca, 18 de Huarochiri-Lima y 19 de Puno). Los resultados muestran que la frecuencia del alelo mutante A es muy baja (máximo 12,5% en mestizos de Lima), o ausente en las distintas subpoblaciones. Asimismo, no se detectó ningún genotipo homocigoto AA en las 135 muestras estudiadas. Una implicancia práctica de la baja frecuencia del alelo A mutante en nuestra población sería su utilidad en los casos donde su prevalencia esté asociado a la susceptibilidad a enfermedades inmunológicas, infecciosas e inflamatorias. Aunque otra consecuencia es que debemos buscar nuevos alelos o variantes en este gen para asociarlos a la susceptibilidad a tales enfermedades.

The mutant allele A of the -308 G/A polymorphism of the gene TNFA (tumoral necrosis factor alpha) is involved to higher protein synthesis and associated to susceptibility for immune, infectious and inflammatory diseases. Our goal is to establish allelic and genotypes distribution of this polymorphism in different Peruvian subpopulatios to asses its value as risk factor predictor for these diseases. Polymorphism-308 G/A del gen TNF alfa was determined by PCR-RFLP in the DNA of 7 subpoulation groups: 20 mestizos from Lima; 56 Amazonian natives (44 from Andoas- Loreto and 12 from the Amazonas Department); 59 Andean natives (12 from Ancash, 10 from Cajamarca, 18 de Huarochiri-Lima y 19 de Puno Departments). The frequency of allele A was very low (at a maximum of 12,5%) or absent in different subpopulations. Moreover, no homozygous (AA) was detected. A practical consequence of the low frequency of allele A is that it can be useful if associated to immunological, infectious and inflammatory diseases. Another consequence indeed, is that we are urged to find more frequent alleles showing association with these diseases.

Detección de mutaciones en el gen MYOC/TIGR en pacientes peruanos con glaucoma primario de ángulo abierto / Detection of mutations in MYOC/TIGR gene in Peruvian primary open angle glaucoma patients

El objetivo de esta investigación fue identificar variantes en el exón 3 del gen miocilina (MYOC/TIGR) en pacientes peruanos con Glaucoma Primario de Ángulo Abierto (GPAA). Es en este exón del gen MYOC donde se encuentra la mayoría de mutaciones en pacientes con GPAA a nivel mundial. Material y métodos: Las muestras de ADN fueron obtenidas de 70 pacientes con GPAA y sus respectivos controles del Instituto Nacional de Oftalmología (INO) Lima-Perú, mediante técnicas estandarizadas. Dos fragmentos que comprenden el exón 3 del gen MYOC fueron amplificados por PCR y evaluados mediante Conformation Sensitive Gel Electrophoresis (CSGE) para identificar las variantes. Los segmentos con resultado positivo fueron secuenciados y sus cromatogramas analizados para identificar el cambio de frecuencia. Resultados: Dos pacientes diagnosticados con GPAA, presentaron cambios en la secuencia del exón 3 del gen MYOC. Un polimorfismo neutro denominado Thr325Thr y una nueva mutación Gly326Ser.Conclusiones: El polimorfismo neutro Thr325Thr es una de las muchas variaciones que se han reportado en estudios anteriores en el exón 3 del gen MYOC. Sin embargo la mutación Gly236Ser, aún no reportada en bases de datos, sugiere un rol importante en la función de la miocilina, convirtiéndola en una mutación casual de GPAA en el paciente analizado. El hallazgo de esta mutación permitirá el estudio de los miembros de la familia para un diagnóstico temprano y un manejo adecuado de la enfermedad.

The aim of this study was to identify variations in exon 3 of the myocilin gene (MYOC/TIGR) sequence in Peruvian primary open angle glaucoma (POAG) patients. This exon of the MYOC gene is where most of the mutations are located in POAG patients worldwide. Material and methods: DNA samples of 70 diagnosed POAG patients and controls were obtained from INO (Instituto Nacional de Oftalmología) following customary procedures. We amplified exon 3 of MYOC gene in two fragments by PCR. These products were evaluated with conformation sensitive gel electrophoresis (CSGE). Sequence variations found were sent for sequence analysis and chromatograms were read to identify nucleotide changes. Results: PCR products of two diagnosed POAG patients showed sequence changes in exon 3 of MYOC gene. One known neutral polymorfism Th325Thr and a novel mutation Gly326Ser, were detected. Conclusions: The Thr325Thr polymorfism, is a previously reported variation in exon 3 of the MYOC gene. However Gly236Ser mutation suggests an important rol in myocilin function, becoming a causal disease mutation of POAG in analyzed patients. Our finding of a novel mutation in MYOC/TIGR will contribute to study family members of the proband to make early diagnoses with regular clinical visits and effective treatment.

Three novel polymorphic microsatellite markers for the glaucoma locus GLC1B by datamining tetranucleotide repeats on chromosome 2p12-q12

In order to identify new markers around the glaucoma locus GLC1B as a tool to refine its critical region at 2p11.2-2q11.2, we searched the critical region sequence obtained from the UCSC database for tetranucleotide (GATA)n and (GTCT)n repeats of at least 10 units in length. Three out of four potential microsatellite loci were found to be polymorphic, heterozygosity ranging from 64.56 percent to 79.59 percent. The identified markers are useful not only for GLC1B locus but also for the study of other disease loci at 2p11.2-2q11.2, a region with scarcity of microsatellite markers.

Determinación electroforética del genoma de un virus asociado a encefalitis equina en el departamento de San Martín / Electrophoretic determination genome of a virus associated with equine encephalitis in the department of San Martin

La encefalitis equina es una enfermedad viral que afecta al sistema nervioso de caballos y otros mamíferos (incluyendo humanos). Desde 1984 se han detectado varios casos en el departamento de San Martín con sintomatología e histopatología semejantes a los alfavirus (genoma de 1 segmento de RNA), sin embargo los estudios serológicos y caracterización de microscopía sugerían la presencia de un orbivirus (genoma de 10 segmentos de RNA). Hipótesis inesperada por la ausencia de orbivirus asociados con encefalitis equina en el nuevo continente. El objetivo principal del proyecto es dilucidar a nivel molecular e identificar la naturaleza del virus asociado a la encefalitis equina en el departamento de San Martín. Utilizando las técnicas de electroforesis se determinó con mayor precisión el tipo de virus involucrado. Los análisis de ARN de aislamiento virales de animales enfermos y sanos colectados en 1997 de una zona endémica y de animales aparentemente sanos colectados en 2002 de la misma zona confirmaron que el genoma está constituido en 10 segmentos de ARN de cadena doble correspondiente al género orbivirus de la Familia de los Reoviridae. Estos datos determinan que el virus aislado en el departamento de San Martín es un orbivirus y que además es el primero causando encefalitis equina en Sudamérica.

The equine encephalitis is a viral disease that affects nervous system of horses and other mammals (including humans). From 1984 several cases with symptomatology and histopathology similar with Alphavirus (1 segment RNA genome) have been detected in San Martin Deparment, nevertheless serology studies and characterization of electronic microscopy indicated compatibility with an orbivirus (10 segment RNA genome). The molecular characterization using electrophoresis will unequivocally determine the type of virus. The RNA analysis of viral isolations from healthy and ill animals collected in 1997 of an endemic zone and animals apparently healthy collected in 2002 from the same zone confirmed that the viral genome is constituted by 10 segments of RNA corresponding to orbivirus genus of the Family Reoviridae. These data reveal that the virus isolated in the San Martin Department is an orbivirus, the first one associated to equine encephalitis in the South America.

Estudio genético-molecular de glaucoma primario de ángulo abierto en una familia peruana sugiere nuevo locus para glaucoma / Molecular genetic study of primary open-angle glaucoma in a Peruvian family suggests new locus for glaucoma

La contribución de la genética molecular al estudio de enfermedades hereditarias es innegable. Existen numerosos reportes de genes responsables de enfermedades hereditarios que facilitan al diagnóstico, pronóstico y también la posibilidad de terapias cuando se conoce el defecto molecular involucrado. Además, hay cientos de enfermedades en donde la identificación del defecto molecular está cerca porque se han localizado regiones cromosómicas específicas en donde se sabe, residen genes responsables de estas enfermedades. Una estrategia es precisamente, refinar paulatinamente esta ubicación a fin de caracterizar el defecto molecular, todo ello con miras a establecer posibles tratamientos. El glaucoma primario de ángulo abierto (GPAA) es una enfermedad hereditaria que puede llevar a la ceguera si no hay un diagnóstico temprano y tratamiento. Hasta ahora, se conocen seis genes que son responsables de la enfermedad y nuestro grupo está trabajando en la caracterización genético-molecular de GPAA en familias peruana usando marcadores microsatélites a fin de caracterizar su asociación con los seis grupos de marcadores. Reportamos el hallazgo de una familia peruana afectada con GPAA que no segrega con ninguno de los marcadores microsatélites de las diferentes regiones cromosómicas que se sabe están asociadas con la enfermedad. Esto apunto a la existencia de un nuevo locus responsable del GPAA en esta familia.

Molecular genetic studies are increasingly important for the study of heredity diseases and its contribution is well known. There are several hundred reports of genes responsible of genetic diseases that help in diagnosis, prognosis and possible treatment when the molecular defect is known. Primary open-angle glaucoma (POAG) is a hereditary disease that can lead to blindness if untreated. There are six known loci that can cause it and or group is working on the characterization of Peruvian families using microsatellite markers located on regions known to harbor glaucoma genes. We found a Peruvian family that does not segregate with any of the markers located near known glaucoma loci. This would account for a new locus responsible for the disease in this family.

Mapeo cromosómico y refinamiento de la localización de un gen de glaucoma en 2cen-2q12 en una familia peruana: avances hacia la identificación del gen GLC1B / Chromosome mapping and refinement of the location of a gene of glaucoma in 2cen-2q12 in a Peruvian family: advances towards to identification of the gene GLC1B

La genética molecular es una herramienta que está revelando los genes responsables de enfermedades hereditarias, incluso algunos de ellos han sido ya identificados y caracterizados. En otros genes la identificación está más cercana porque se les ha localizado (mapeado) en regiones cromosómicas específicas donde su búsqueda se refina paulatinamente. El glaucoma primario de ángulo abierto (GPAA) es una anomalía hereditaria que sin tratamiento puede llevar a la ceguera, pero si es detectado tempranamente, permite preservar la visión. Hay 6 loci (genes) para GPAA: GLC1A localizado en la región cromosómica 1q24.3-q25.2, GLC1B (2cen-q13), GLC1C (3q21-q24), GLC1D (8q23), GLC1E (10p14-p15) y GLC1F (7q35-q36). Hemos estudiado varias familias peruanas con GPAA para analizar su asociación con marcadores en las regiones mencionadas. Una familia de Chincha ha mostrado cosegregación con marcadores de 2cen-q13 indicando que el glaucoma en esta familia pertenece a GLC1B. Un análisis posterior con más familiares nos revela una recombinación que restringe la región crítica para GLC1B a 2cen-q12. Esta reducción en términos genómicos descarta varios millones de nucleótidos y muchos genes de 2q13 facilitando la identificación de GLC1B.

Molecular genetics is an important tool to elucidate the cause of hereditary diseases. One of the strategies used in this type of studies, is to map the gene responsible of the disease to a specific chromosome region. This has helped in the characterization of some genes, but others remain to be identified. Primau Open Angle Glaucoma (POAG) is a hereditary disease that can lead to blindness if untreated. There are six loci for POAG: GLClA on chromosome region lq24.3-q25.2, GLClB (2cenq13), GLClC (3q21-q24), GLClD (8q23), GLClE (10p14p15) y GLClF (7q35-q36). In a study of several POAG Peruvian families we have characterized one that cosegregates with markers of chromosome 2 corresponding to a new reported family for GLCIB located at 2cen-2q13. One additional individual in the family reveals genetic recombination that refines the position to a smaller region in 2cen-q12 eliminating several millions of base pairs in the search of the GLCIB gene.

Optimización del diagnóstico molecular para la enfermedad de Huntington y la Hemocromatosis / Optimization of the molecular diagnosis for Huntington's disease and the Hemocromatosis

La caracterización genética-molecular de las enfermedades es útil para su diagnóstico, pronóstico y, en algunos casos, para diseñar estrategias de tratamiento; esto es posible por el análisis directo de las mutaciones responsables de estas enfermedades. La Enfermedad de Huntington (Corea) es una enfermedad neurodegenerativa que produce movimientos espásticos; rememorando una coreografía, conlleva a demencia y muerte. A nivel molecular, la enfermedad es causada por una expansión en el trinucleótido (CAG)n que se encuentra en el exon 1 del gen responsable HD en la región cromosómica 4p 16. La hemocromatosis hereditaria es una enfermedad primariamente hepática, que provoca cirrosis, diabetes y deficiencia cardiaca y alrededor de un tercio de pacientes muere por carcinoma hepatocelular. Más del 95 por ciento de casos de hemocromatosis en USA y EUROPA es provocado por mutaciones en el gen HFE (6p21), principalmente por las mutaciones C282Y y H63D. En los laboratorios del Instituto de Genética y Biología Molecular de la USMP se ha implementado el diagnóstico molecular de estas enfermedades como el inicio de un servicio que ya incluye otras anomalías genéticas. Tenemos interés en dirigirlo paulatinamente hacia las enfermedades y mutaciones más frecuentes en las poblaciones peruanas.

The molecular characterization of the mutations causing hereditary diseases are important tools for diagnosis, prognosis and eventually treatment. Huntington's disease is a neurodegenerative disease producing spastic uncontrolled movements and is caused by the expansion of a trinucleotide (CAG)n with in the first exon of the gene HD located at 4p16. Hemocromatosis is a liver disease causing cirrosis, diabetes and heart problems, in addition one third of patients dies of hepatocarcinoma. Almost all cases of hemocromatosis are due to mutations in the gene HFE at 6p21, being C282Y and H63D the mutations most frequently detected in Europe and USA. We are establishing the molecular diagnosis of different diseases starting with Huntington disease and hemochromatosis as the begining of a service to the Peruvian comunity.

Alta frecuencia de un haplotipo susceptible del gen Mannose Binding Lectin, en las islas AnapiaSuana del Lago Titicaca / High frequency of a haplotipo capable of the gene Mannose Binding Lectin, in the islands AnapiaSuana of the Lake Titicaca

Se determinaron las combinaciones de variantes genéticas en 4 sitios del gen de la proteína asociada al sistema inmune MBL (mannose binding lectin), en 19 pobladores de las islas de Anapia-Suana del Lago Titicaca. Se encuentran solamente 3 combinaciones (haplotipos): LYPB, HYPA y LYPA y se observa alta frecuencia (0.58) del haplotipo defectuoso LYPB en las mencionadas islas sobrepasando a otras frecuencias previamente reportadas en el mundo. Este haplotipo es poco frecuente en poblaciones europeas, asiáticas y africanas. La deficiencia sérica de LYPB predispone a infecciones como tuberculosis, VIH-1 y a enfermedades autoinmunes como artritis reumatoide y lupus eritematoso entre otras. Con estos antecedentes nuestros futuros esfuerzos se dirigirán a investigar la razón de la alta frecuencia de LYPB en estas islas y determinar la de las otras islas aledañas.

We have analized the combination of variants at 4 sites of the gene MBL (mannose binding lectin) which is part of the immune system, in 19 normal individuals from the islands of Anapia-Suana in the Lake Titicaca. OnIy 3 combinations (haplotypes) were registered: LYPB, HYPA and LYPA; the proportion of the pressumed defective haplotype LYPB is 0.58 being the highest ever recorded. This haplotype is rare among European, Asian and African populations. It predisposes to infectious diseases as tuberculosis and AIDS as well as autoimmune diseases like reumatoid arthritis and lupus erithematosumo This finding lead our future efforts to elucidate the reason of this high frequency of LYPB and to determine its proportion in other islands of the Titicaca Lake.