RESUMO
Abstract Introduction: Drug resistance mechanisms may be associated with decreased cell death and its induction may depend on the response to oxidative stress caused by hypoxia. The correlation between hypoxia-inducible factor HIF-1α, the number of reactive oxygen species and their effect on cell survival has not yet been evaluated. Objective: The purpose of this study was to evaluate the effect of HIF-1α activity and reactive oxygen species (ROS) accumulation in apoptosis of colon cancer cells. Materials and methods: HT29 colon cancer cells were treated with Cobalt(II) chloride (CoCl2) or doxorubicin and the activity of HIF-1α was determined by ELISA assay. ROS were determined using fluorescence probe carboxy-H2DFFDA. Apoptosis was assessed by caspase-3 activation analysis, and PUMA and BAX mRNA levels by qRT-PCR. The reduction of the antiapoptotic effect due to hypoxia was attenuated by use of the endonuclease APE-1 (E3330) inhibitor. The endonuclease E3330 APE-1 inhibitor allowed evaluating the effect of ROS generated by doxorubicin and CoCl2 on apoptosis. Results: Chemical hypoxia in combination with doxorubicin is an oxidative stressor in HT29 cells and induces a reduction in the apoptotic process in a time-dependent manner. Conclusion: Resistance to hypoxia and doxorubicin-mediated cell death could be controlled by a mechanism related to the activity of HIF-1α and the amount of reactive oxygen species generated.
Resumen Introducción. Los mecanismos de resistencia a drogas podrían asociarse con disminución en la muerte celular y su inducción podría depender de la respuesta al estrés oxidativo que origina la hipoxia. La correlación entre factor inducible por hipoxia HIF-1α, cantidad de especies reactivas de oxígeno y su efecto sobre la supervivencia celular aún no ha sido evaluada. Objetivo. Evaluar el efecto de la inducción de la actividad de HIF-1α y la cantidad de especies reactivas de oxígeno sobre la apoptosis en células de cáncer de colon. Materiales y métodos. Células de cáncer de colon HT29 fueron tratadas con cloruro de cobalto (CoCl2) o doxorrubicina; la actividad de HIF-1α se evaluó por ELISA. Las especies reactivas de oxígeno fueron determinadas con sonda fluorescente carboxi-H2DFFDA. La apoptosis fue evaluada por la actividad de caspasa-3 y los niveles de mRNA de los genes proapoptóticos PUMA y BAX por qRT-PCR. El inhibidor de la endonucleasa APE-1 E3330 permitió evaluar el efecto de las especies reactivas de oxígeno generadas por doxorubicina y CoCl2 sobre la apoptosis. Resultados. La hipoxia química combinada + doxorubicina es estresor oxidativo en células HT29 e induce una reducción en el proceso apoptótico de manera tiempo dependiente. Conclusión. La resistencia a la muerte celular mediada por hipoxia y doxorubicina podría estar controlada por un mecanismo relacionado con la actividad de HIF-1α y la cantidad de especies reactivas de oxígeno generadas.
RESUMO
resumen Introducción: El microambiente tumoral influye en el comportamiento de las células cancerosas. Especialmente, el estímulo de agentes estresantes, como la hipoxia, se convierte en un factor crítico para la evolución y el tratamiento del cáncer. La reacción celular frente a diversos estímulos se manifiesta en la activación de vías de señalización como la JAK/STAT, una de las más importantes por sus efectos en la diferenciación y proliferación celular. Objetivo: Evaluar el estado de la vía JAK/STAT mediante la expresión o activación de la proteína STAT3 en células de cáncer de cuello uterino (HeLa) y en células endoteliales (EA.hy926) sometidas a hipoxia. Materiales y métodos: Las líneas celulares se sometieron a condiciones de hipoxia física (1 % de O2) o química (100 μM de deferoxamina, DFO) durante dos, seis y 24 horas. Mediante Western blot se determinó el cambio en la expresión y activación de STAT3, y mediante inmunofluorescencia indirecta su localización subcelular. Resultados:. La hipoxia se evidenció por la activación y translocación al núcleo del HIF-1. Ni la hipoxia física ni la química alteraron la expresión de STAT3, pero sí la activación, según se comprobó por su fosforilación y su translocación al núcleo en los dos modelos bajo estudio. Conclusiones: Se evidenció la importancia de la hipoxia como un estímulo que modifica la activación de la proteína STAT3 en las células HeLa y EA.hy926, lo cual la convierte en un elemento importante en el diseño de estrategias terapéuticas contra el cáncer.
Abstract Introduction: The biological behavior of cancer cells is influenced by the tumor microenvironment in which they develop. In this context, stressor stimuli such as hypoxia are considered critical for tumor development and therapeutic management. Cellular response to various stimuli is evidenced in the activation of intracellular signaling pathways such as JAK/STAT, which is one of the most important for its effects in differentiation and cell proliferation. Objective: To evaluate the condition of the JAK/STAT pathway through the expression/activation of the STAT3 protein in cervix cancer cells (HeLa) and endothelial cells (EA.hy926) subjected to ypoxia. Material and methods: Cell lines were subjected to physical (1% O2) or chemical (deferoxamine, DFO, 100 μM) hypoxia for 2, 6 and 24 hours. Changes in the expression and activation of STAT3, and its subcellular localization by indirect immunofluorescence, were determined by western blot. Results: Hypoxia was evidenced by the activation and translocation to the nucleus of HIF-1. Neither physical nor chemical hypoxia altered STAT3 expression, but it did affect its activation, as seen in its phosphorylation and translocation to the nucleus in the two models under study. Conclusions: The present study highlights the importance of hypoxia as a stimulus that modifies the activation of the STAT3 protein in HeLa and EA.hy926 cells, which makes it an important factor in the design of therapeutic strategies against cancer.
Assuntos
Feminino , Humanos , Transdução de Sinais/efeitos dos fármacos , Neoplasias do Colo do Útero/patologia , Células Endoteliais/patologia , Fator de Transcrição STAT3/metabolismo , Hipóxia/metabolismo , Fosforilação/fisiologia , Fator de Transcrição STAT3/químicaRESUMO
Los sistemas educativos tradicionales han convertido a los estudiantes en entidades pasivas que guardan información transitoriamente, sin mayores capacidades para procesarla y aplicarla a la solución de situaciones de la vida diaria. La discusión generalizada entre los investigadores de la educación plantea la necesidad de cambiar las estrategias pedagógicas que han favorecido esas situaciones, para permitir una formación integral del individuo como ser capaz de razonar, crear, innovar y desarrollarse autónomamente. Las exigencias gubernamentales, institucionales e incluso las políticas de la globalización y el desarrollo del ser humano basado en la economía del conocimiento reclaman ese cambio de estrategias en el sistema pedagógico de enseñanza-aprendizaje; pues aunque éste se encuentre amenazado por la resistencia natural que ofrece el enfrentamiento con una cultura establecida, debe darse desde el aula de una manera inmediata. Como respuesta a esa necesidad, la Unidad de Bioquímica del Instituto de Ciencias Básicas de la Facultad de Medicina (Universidad del Rosario) plantea una estrategia no tradicional en pos del cambio.
Traditional educative systems, had convert students in passive recipient, who are keeping information without any possibility to process and apply it for the solution of daily problems. General discussion between educative researchers, had been establish the necessity to change the educative strategies that have been supporting those situations, looking for an integral education of the individual in terms of the capacity to argue, to create, to innovate, to develop by him self with independence. Governments, institutions and the politics requirements, that handle the globalization and the human development based in the knowledge economy, demand changes in the pedagogical system strategies in spite of the barriers from the traditional educative system. Responding to these necessity, the Biochemistry Department belong to the Basic Sciences Institute from the Medicine Faculty in the University of Rosario, is applying a different pedagogical strategy.
Assuntos
Humanos , Educação , Mudança Social , Estudantes , Gestão da Qualidade Total , Docentes , AprendizagemRESUMO
El presente trabajo describe la producción de la proteína recombinante JAK2, empleando un sistema de vectores de expresión baculovirales. La infección de células Sf9, derivadas del tejido de ovario de Spodoptera frugiperda, permitió establecer las condiciones óptimas de dilución del virus en 10 µl/ml de medio y de tiempo de recolección en 72 horas post-infección. Se recolectaron y ultrafiltraron extractos correspondientes a la infección de 5 x 10 a la 7 células, aproximadamente, y se sometieron a cromatografía de intercambio iónico (DEAE-Sephacel), lográndose purificar parcialmente la proteína JAK2 por medio de un gradiente continuo de fuerza iónica (NaCl 10-500 mM). La presencia de JAK2 se verificó por Western blot, empleando un anticuerpo policlonal producido en conejo contra los residuos 758-776 de JAK2 de ratón. Los resultados indicaron que la proteína obtenida por este sistema de expresión se sintetiza en forma fosforilada/activada