Fungal-host interactions: insights into microRNA in response to Paracoccidioides species

BACKGROUND Paracoccidioides spp. causes paracoccidioidomycosis (PCM), an important and frequent systemic mycosis that occurs in Latin America. The infectious process begins with contact between the fungus and lung cells, and the molecular pattern of this interaction is currently poorly understood. MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNAs that regulate the gene expression in many biological processes, including in the infections. OBJECTIVE This study aimed to analyse the expression of miRNAs in lung cells as response to infection by Paracoccidioides spp. METHODS A quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR) based screening was employed to verify differentially expressed miRNAs in human lung cells infected with three different species; Paracoccidioides lutzii, Paracoccidioides americana, and Paracoccidioides brasiliensis. Furthermore, the in silico predictions of target genes and pathways for miRNAs were obtained. FINDINGS The results showed that miRNAs identified in the lung cells were different according to the species studied. However, based on the predicted targets, the potential signaling pathways regulated by miRNAs are common and related to adhesion, actin cytoskeleton rearrangement, apoptosis, and immune response mediated by T cells and TGF-β. MAIN CONCLUSIONS In summary, this study showed the miRNAs pattern of epithelial cells in response to infection by Paracoccidioides species and the potential role of these molecules in the regulation of key pathogenesis mechanisms of PCM.

Essential oils and major compounds of Hedychium coronarium Koenig (Zingiberaceae) against pathogenic yeast of Candida and Cryptococcus genus / Óleos essenciais e compostos majoritários de Hedychium coronarium Koenig (Zingiberaceae) contra leveduras patogênicas dos gêneros Candida e Cryptococcus

Among the major causative agents of invasive fungal infections stands out the opportunistic yeasts of Candida and Cryptococcus. Regarding the problem of the high incidence of infections by these agents and the difculty of treating the low stockpile of antifungal drugs and the high toxicity of most therapies, the search for new antifungal compounds has been highlighted in recent decades. Hedychium coronarium, popularly known as "lírio-do-brejo" or "gengibre-branco" features several previously reported biological activities, including antimicrobial activity. Compound 1.8-cineole is the major compound in essential oil extracted from roots of H. coronarium, while caryophyllene oxide presents itself as the major in essential oil extracted from leaves of this plant. Our data show strong antifungal activity of compounds, against species of Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida krusei, Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, with minimal inhibitory concentration and minimal fungicidal concentration equal to 0.2 % (v/v) for essential oil extracted from roots, while the essential oil extracted from leaves showed no activity against yeasts. The caryophyllene oxide showed higher antifungal activity for Cryptococcus spp. Thus, our results showed that the essential oil of rhizome is a promising antifungal agent against pathogenic yeasts.(AU)

Candida spp e Cryptococcus spp estão classifcadas entre os maiores causadores de infecções fúngicas invasivas em pacientes imunocomprometidos. Diante a alta incidência destas infecções por estes agentes e a difculdade do sucesso no tratamento, decorrente do baixo arsenal de fármacos antifúngicos e da alta toxicidade presente na maioria dos esquemas terapêuticos, a busca por novos compostos antifúngicos tem sido alvo de diversos estudos nas últimas décadas. Hedychium coronarium, popularmente conhecido como "lírio-do-brejo" ou "gengibre-branco", apresenta diversas atividades biológicas já descritas, entre elas a atividade antimicrobiana. O composto 1.8-Cineol é o composto majoritário presente no óleo essencial extraído de raízes de H. coronarium e o composto óxido de cariofleno é o composto majoritário extraído das folhas desta planta. Nossos resultados mostram que os compostos extraídos de H. coronarium apresentam forte atividade contra Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida krusei, Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii, com valores de concentração inibitória minima e concentração fungicida minima igual a 0,2 % (v/v) para o óleo essencial extraído das raízes, enquanto que o óleo essencial extraído das folhas, não mostrou atividade contras as leveduras. O composto óxido de cariofleno mostrou maior atividade antifúngica para Crytopcoccus spp. Assim, nossos dados mostraram que o óleo essencial extraído das raízes de H. coronarium, é um agente antifúngico promissor contra leveduras patogênicas.(AU)

Influence of the Paracoccidioides brasiliensis 14-3-3 and gp43 proteins on the induction of apoptosis in A549 epithelial cells

The fungal strain Paracoccidioides brasiliensis remains viable inside of epithelial cells and can induce apoptosis in this population. However, until now, the molecules that participate in this process remained unknown. Thus, this study evaluated the contribution of two P. brasiliensis molecules, the 14-3-3 and glycoprotein of 43 kDa proteins, which had been previously described as extracellular matrix adhesins and apoptosis inductors in human pneumocytes. Accordingly, epithelial cells were treated with these molecules for different periods of time and the expression of the apoptosis regulating-proteins Bak, Bax, Bcl-2, p53 and caspases were evaluated by terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labelling, flow cytometry and real-time polymerase chain reaction analysis. Our results demonstrated that treatment with these molecules induces apoptosis signalling in pulmonary epithelial cells, showing the same pattern of programmed cell-death as that observed during infection with P. brasiliensis. Thus, we could conclude that P. brasiliensis uses these molecules as virulence factors that participate not only in the fungal adhesion process to host cells, but also in other important cellular mechanisms such as apoptosis.

Environmental isolation, biochemical identification, and antifungal drug susceptibility of Cryptococcus species

Introduction The incidence of opportunistic fungal infections has increased in recent years and is considered an important public health problem. Among systemic and opportunistic mycoses, cryptococcosis is distinguished by its clinical importance due to the increased risk of infection in individuals infected by human immunodeficiency virus. Methods To determine the occurrence of pathogenic Cryptococcus in pigeon excrement in the City of Araraquara, samples were collected from nine environments, including state and municipal schools, abandoned buildings, parks, and a hospital. The isolates were identified using classical tests, and susceptibility testing for the antifungal drugs (fluconazole, itraconazole, voriconazole, and amphotericin B) independently was also performed. After collection, the excrement samples were plated on Niger agar and incubated at room temperature. Results A total of 87 bird dropping samples were collected, and 66.6% were positive for the genus Cryptococcus. The following species were identified: Cryptococcus neoformans (17.2%), Cryptococcus gattii (5.2%), Cryptococcus ater (3.5%), Cryptococcus laurentti (1.7%), and Cryptococcus luteolus (1.7%). A total of 70.7% of the isolates were not identified to the species level and are referred to as Cryptococcus spp. throughout the manuscript. Conclusions Although none of the isolates demonstrated resistance to antifungal drugs, the identification of infested areas, the proper control of birds, and the disinfection of these environments are essential for the epidemiological control of cryptococcosis. .

Candida parapsilosis complex water isolates from a haemodialysis unit: biofilm production and in vitro evaluation of the use of clinical antifungals

Candida parapsilosis, currently divided into three distinct species, proliferates in glucose-rich solutions and has been associated with infections resulting from the use of medical devices made of plastic, an environment common in dialysis centres. The aims of this study were (i) to screen for Candida orthopsilosis and Candida metapsilosis (100 environmental isolates previously identified as C. parapsilosis), (ii) to test the ability of these isolates to form biofilm and (iii) to investigate the in vitro susceptibility of Candida spp biofilms to the antifungal agents, fluconazole (FLC) and amphotericin B (AMB). Isolates were obtained from a hydraulic circuit collected from a haemodialysis unit. Based on molecular criteria, 47 strains were re-identified as C. orthopsilosis and 53 as C. parapsilosis. Analyses using a formazan salt reduction assay and total viable count, together with microscopy studies, revealed that 72 strains were able to form biofilm that was structurally similar, but with minor differences in morphology. A microtitre-based colorimetric assay used to test the susceptibility of fungal biofilms to AMB and FLC demonstrated that the C. parapsilosis complex displayed an increased resistance to these antifungal agents. The results from these analyses may provide a basis for implementing quality controls and monitoring to ensure the microbiological purity of dialysis water, including the presence of yeast.

Genetic diversity and antifungal susceptibility testing of Trichosporon asahii isolated of Intensive Care Units patients / Diversidade genética e suscetibilidade a antifúngicos de Trichosporon asahii isolado de pacientes de Unidades de Terapia Intensiva

Trichosporon asahii is an opportunistic pathogen, associated with a high mortality rate in immunocompromised patients. In this study, ten isolates, recovered from oral cavity and urine of patients in Intensive Care Units (ICU) over six months, were identified by classical and molecular methods, typed by RAPD and tested in vitro for susceptibility to fluconazole, itraconazole, 5-flucytosine and amphotericin B. A total agreement between the identification of Trichosporon sp by PCR based on sequences of the Internal Transcribed Spacer Regions (ITS) and on the sequences of small-subunit (SSU) ribosomal DNA (rDNA) was found. Randomly amplified of polymorphic DNA (RAPD), with primers P6 and M13, was used to determine the genomic profiles. The dendogram analysis indicated that almost all strains showed similarity >0.9 among them and all strains were multidrug-resistant. This study brings new results on the identification and genotyping of T. asahii isolated from Brazilian ICU patients and information about their antifungal drugs susceptibility.

Trichosporon asahii é um patógeno oportunista que apresenta altos índices de mortalidade em pacientes imunocomprometidos. No presente trabalho, dez cepas foram isoladas da cavidade bucal e urina de pacientes internados na Unidade de Terapia Intensiva (UTI) por seis meses. Todos os isolados foram identificados por métodos clássicos e moleculares, tipados por RAPD e testados in vitro quanto à sensibilidade ao fluconazol, itraconazol, 5-fluorocitosina e anfotericina B. Houve concordância total entre a identificação de Trichosporon sp por PCR baseado na seqüência da região ITS (Internal Transcribed Spacer) e na seqüência da subunidade menor do DNA ribossômico (rDNA). Os perfis genéticos foram determinados por RAPD utilizando dois iniciadores P6 e M13. A análise do dendrograma mostrou que a maioria das amostras apresentou alta similaridade entre elas (>0.9) e todas foram multidrogas resistentes. Este estudo traz novos resultados em relação à identificação e genotipagem de isolados brasileiros de T. asahii em pacientes internados em UTI, bem como dados sobre o perfil de sensibilidade aos antifúngicos.

Monitoramento de fungos anemófilos e de leveduras em unidade hospitalar / Monitoring of airborne fungus and yeast species in a hospital unit

OBJETIVO: Monitorar e caracterizar fungos anemófilos e leveduras de fontes bióticas e abióticas de uma unidade hospitalar. MÉTODOS: As coletas foram realizadas mensalmente e em dois períodos, do centro cirúrgico e unidades de terapia intensiva adulto e neonatal em hospital de Araraquara, Estado de São Paulo. Para coleta de fungos anemófilos foi utilizado amostrador tipo Andersen de simples estágio. A pesquisa de leveduras foi feita das mãos e de orofaringe de profissionais de saúde, bem como de superfícies de leitos e de maçanetas das áreas críticas. RESULTADOS: Foram recuperados do centro cirúrgico 32 gêneros de fungos anemófilos e 31 das unidades de terapia intensiva. Os gêneros mais freqüentemente isolados foram Cladophialophora spp., Fusarium spp., Penicillium spp., Chrysosporium spp. e Aspergillus spp. Durante o período de estudo, houve reforma e implantação de uma unidade dentro do hospital, que coincidiu com o aumento na contagem de colônias de Cladophialophora spp., Aspergillus spp. e Fusarium spp. Leveduras foram encontradas em 39,4 por cento dos profissionais de saúde (16,7 por cento das amostras dos espaços interdigitais, 12,1 por cento do leito subungueal e 10,6 por cento da orofaringe) e, em 44 por cento das amostras do mobiliário, com predomínio do gênero Candida (C. albicans, C. guilliermondii, C. parapsilosis e C. lusitaniae) seguido por Trichosporon spp. CONCLUSÕES: Observou-se número relativamente elevado de fungos anemófilos (potencialmente patogênicos) em áreas especiais e níveis expressivos de leveduras em fontes bióticas e abióticas. O monitoramento microbiológico ambiental deve ser realizado, principalmente em salas especiais com pacientes imunocomprometidos, sujeitos à exposição de patógenos do meio ambiente, assim como, advindos de profissionais de saúde.

Adesäo e invasäo de Paracoccidioides brasiliensis em cultura de células vero / Adherence and invasion of Paraccidioides brasiliensis (isolate 18) to Vero cells

A capacidade de aderir e invadir tecidos do hospedeiro tem sido imputada como importante mecanismo de patogenicidade. Neste trabalho foi estudado o processo de adesäo e invasäo de P. brasiliensis amostra 18, fase L, as culturas celulares da linhagem Vero, usando várias técnicas de microscopia. P. brasiliensis aderiu às células Vero após 30 minutos e formas intracitoplasmáticas apareceram após 5 horas de infecçäo. As células Vero apresentaram modificaçöes na presença do fungo, comportando-se como célula fagocítica, formando protusöes e projeçöes citoplasmáticas em dedo de luva, na tentativa de interiorizar o fungo. O fungo aderido às células exibiu padräo de reconhecimento semelhante ao de culturas com os soros anti-"cell-free" e anti-gp 43. Ambos os antígenos distribuíram-se regularmente na parede fúngica, de maneira específica, e a gp 43 foi mais evidente na conexäo entre as células mäe e filha e também nas proximidades da interaçäo fungo-célula. Células de P. brasiliensis näo foram observadas intracelularmente após tratamento com citocalasina D, sugerindo que um dos mecanismos que o fungo utiliza durante o processo de invasäo e via microfilamentos de actina. Por meio deste trabalho, informaçöes relevantes sobre os processos de adesäo e p emvolvimento do citoesqueleto durante a invasäo puderam ser demonstradas, podendo auxiliar no entendimento da patogênese de P. brasiliensis.

Candidíase vulvovaginal com episódios de repetiçäo: epidemiologia e biotipagem de isolados de Candida albicans / Recurrent vulvovaginal candidiasis: biotyping and epidemiology of Candida albicans isolates

Na presente pesquisa, os resultados das avaliaçöes microbiológicas das secreçöes vaginais para presença de leveduras por exame a fresco/coloraçäo de Gram e cultura foram positivos, respectivamente em 69,4 por cento e 87,1 por cento. Cento e nove isolados de Candida sp foram recuperados de secreçöes vaginais, cavidade bucal, fezes e urina de 29 pacientes com candidíase vulvovaginal em vários episódios de repetiçäo. Foram identificados 86,2 por cento como C. albicans, 3,7 por cento com C. glabrata, 3,7 por cento com C. guilliermondi e 6,4 por cento como C. famata. O biótipo 177 foi mais freqüente nas secreçöes vaginais (46,8 por cento) nas fezes (53,8 por cento), na urina (50 por cento) e cavidade bucal (43,7 por cento). Pelo sistema killer foram diferenciados seis tipos de C. albicans com predominância do biótipo 888 em 87,2 por cento das amostras de secreçöes vaginais, 100 por cento em fezes, 88,9 por cento em urina e 68,7 por cento da cavidade bucal. Todos isolados de Candida albicans pertenciam ao sorogrupo A.

Fatores envolvidos na patogênese fúngica / Virulence factors in the fungal pathogenesis

Progresso considerável vem ocorrendo no estudo de fatores que contribuem para a patogenicidade dos fungos. Este artigo sumariza alguns dos fatores de virulência potenciais e sua contribuiçäo à patogênese. O papel de vários fatores, como: aderência aos tecidos do hospedeiro, variabilidade fenotípica, toxinas e enzimas, é discutido, assim como o provável papel das proteínas de choque térmico. Combinaçöes destas propriedades, mais do que sua açäo isolada, podem servir como mecanismo de virulência nos fungos.

Correlaçäo entre produçäo de proteinase e patogenicidade de cepas de C. albicans isoladas de águas recreacionais / Correlative relationship between proteinase production and pathogenicity of various straisn of Candida albicans from recreational waters

Cepas de Candida albicans isoladas de águas recreacionais, representadas por seis biótipos, todas sorotipo "A", foram avaliadas quanto à produçäo de proteinase, e este parâmetro correlacionado com a virulência para camundongos. O teste foi realizado pela inoculaçäo intravenosa em camundongos. O fígado e os rins destes animais foram removidos 6, 24 horas, 3, 7, 14, 21 e 28 dias após a inoculaçäo com C. albicans; triturados, homogeneizados e plaqueados em meio adequado. Colônias leveduriformes foram contadas e os resultados expressos em unidades formadoras de colônia (U.F.C.) por órgäo. A atividade de proteinase - observada em 37 por cento das cepas - foi identificada como um polipeptídeo de 44 kDa empregando-se eletroforese em gel de poliacrilamida, ao qual se incoporou substrato adequado. Houve diferenças estatisticamente significativas entre a presença ou ausência de proteinase e capacidade de colonizaçäo de fígado e rins. Amostra proteinase positiva produziu infecçäo fatal em 21 dias, enquanto camundongos inoculados com cepa deficiente näo morreram até o 28§ dia. Estes resultados evidenciam que a atividade de proteinase é um dos fatores de virulência associados à C. albicans e a sua expressäo em cepas isoladas de águas recreacionais tem comportamento semelhante ao de espécimes clínicos

Characterization of plasmid-related antigen of Yersinia enterocolitica by immunological techniques

Yersínia enterocolitica tem sua virulência relacionada a plasmídeo de 40-48-MDa que codifica proteínas que podem ser expressas nas membranas ou excretadas no meio de cultura. Procurou-se determinar o perfil dessas proteínas em cepas de Y. enterocolitica com e sem o plasmídeo de 40-48-MDa, através de gel de poliacrilamida com SDS (SDS-PAGE). Procurou-se também estudar as condiçöes ótimas de cultura de bactérias para expressäo dessas proteínas e finalmente analisá-las empregando a técnica de Immunoblot e utilizando anti-soro preparado com a amostra com e sem plasmídeo. Esses estudos resultaram na demonstraçäo da ocorrência, entre outros, de uma proteína de 38-kDa, presente apenas na cepa com plasmídeo e que era excretada quando o cultivo era realizado a 37ºC em meio de MOX