Diagnóstico molecular de tuberculosis multidrogorresistente en muestras de esputo mediante el análisis de curvas de melting / Molecular diagnosis of multidrug-resistant tuberculosis in sputum samples by melting curve analysis

RESUMEN Objetivos. Analizar curvas de melting para el diagnóstico de tuberculosis multidrogorresistente a partir de muestras de esputo. Materiales y métodos. Se colectaron muestras de esputo (n = 250) de pacientes con sospecha clínica de tuberculosis pulmonar según resultado de baciloscopia y cultivados en medio sólido Lowenstein Jensen. Según el método de referencia se trabajó con 124 muestras sensibles a rifampicina e isoniacida, 24 resistentes a rifampicina, 33 resistentes a isoniacida y 69 multidrogorresistentes. Se evaluó por PCR en tiempo real y luego por las curvas de melting, se utilizó el gen rpoB como biomarcador de resistencia a rifampicina, y el gen katG y región promotora inhA como biomarcadores de resistencia a isoniacida. La cepa H37Rv fue considerada como control sensible a drogas. Se compararon los resultados del método de referencia y los resultados del análisis de curvas de melting para evaluar los parámetros de sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y valor predictivo negativo. Resultados. La resistencia a rifampicina mostró una sensibilidad de 90,3 %, especificidad de 90,4 %, valor predictivo positivo de 84,8 % y valor predictivo negativo de 94,0 %. La resistencia a isoniacida mostró una sensibilidad de 90,2 %, especificidad de 93,9 %, valor predictivo positivo de 91,1 % y valor predictivo negativo de 93,3 %. La detección de tuberculosis multidrogorresistente mostró valores de 89,9 %, 90,6 %, 78,5 % y 95,9 % para sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y valor predictivo negativo, respectivamente. Conclusiones. El análisis de curvas de melting mostró ser seguro y confiable para ser utilizado en el diagnóstico rápido de tuberculosis multidrogorresistente en muestras de esputo.

ABSTRACT Objectives. To analyze melting curves for the diagnosis of multidrug-resistant tuberculosis from sputum samples. Materials and Methods. Sputum samples (n = 250) were collected from patients with clinical suspicion of pulmonary tuberculosis as a result of bacilloscopy and cultured in solid medium Lowenstein Jensen. According to the reference method, 124 samples sensitive to rifampicin and isoniazid, 24 resistant to rifampicin, 33 resistant to isoniazid, and 69 multidrug-resistant were used. It was evaluated by real-time PCR and then by melting curves, the rpoB gene was used as a biomarker of rifampicin resistance, and the katG gene and inhA promoter region were used as biomarkers of isoniazid resistance. The H37Rv strain was considered a drug-sensitive control. The results of the reference method and the results of the melting curve analysis were compared to evaluate the parameters of sensitivity, specificity, positive predictive value and negative predictive value. Results. Rifampicin resistance showed a sensitivity of 90.3%, specificity of 90.4%, positive predictive value of 84.8% and negative predictive value of 94.0%. Isoniazid resistance showed a sensitivity of 90.2%, specificity of 93.9%, positive predictive value of 91.1% and negative predictive value of 93.3%. The detection of multidrug-resistant tuberculosis showed values of 89.9%, 90.6%, 78.5% and 95.9% for sensitivity, specificity, positive predictive value and negative predictive value, respectively. Conclusions. The melting curve analysis showed to be safe and reliable to be used in the rapid diagnosis of multidrug-resistant tuberculosis in sputum samples.

Caracterización pre analítica de muestras para prueba de susceptibilidad a drogas mediante observación microscópica (MODS) para tuberculosis en la Dirección de Salud Callao / Pre analytical characterization of samples for microscopic-observation drug susceptibility assay (MODS) for tuberculosis in Callao Health Directorate

Objetivo: Describir las características pre analíticas de las muestras tomadas de pacientes con tuberculosis (TB) para la prueba de susceptibilidad a drogas mediante observación microscópica (MODS) de centros de salud de la Dirección Regional de Salud (DIRESA) Callao. Métodos: Se realizó un estudio descriptivo con muestras para la prueba MODS de pacientes sospechosos o continuadores de TB procedentes de los establecimientos de salud de la DIRESA Callao, desde enero del 2009 hasta diciembre del 2012, enviadas al Laboratorio de Referencia Regional. Se determinaron: (1) características del sujeto (sexo, edad, antecedente tratamiento, motivo de toma) y (2) características pre analíticas (tiempo de recepción a laboratorio de referencia, calidad de las muestras, muestra refrigerada, envase adecuado, etiquetado correcto, solicitud llenada correcta). Resultados: Se trabajó con 25 356 muestras para MODS en el período de estudio. Las muestras por mes presentan una tendencia creciente el año 2009 y un alza el segundo semestre del 2012. Las características de los sujetos fueron edad 39,2±19,4 años y 59,8% varones. En 15 091 (59,5%) nunca fueron tratados y 5 149 (20,3%) fueron recaídas. El tiempo de recepción de muestra al centro de referencia fue 3,8±3,4 días; en 55,1% fue 3 días. Solo 66% de las muestras recibidas fueron adecuadas. En relación a la calidad de la muestra 96,9% se refrigeraron, 97,6 tuvieron envase adecuado, 94,3% estuvo correctamente etiquetada y solo 43,6% llenó la solicitud correctamente. Conclusiones: Cerca de la mitad de muestras para MODS procedentes de los centros de salud de la DIRESA Callao en cuatro años presentan limitaciones en cuanto a calidad de la muestra y recopilación de datos de solicitudes, procesos que pueden ser corregidos para un mejor manejo de los pacientes y tener información válida en la vigilancia de la tuberculosis multidrogorresistente en la DIRESACallao.

Objective: To describe the pre analytical characteristics of samples taken from patients with tuberculosis (TB) formicroscopic-observation drug susceptibility assay (MODS) at health care centers of the Callao Regional Health Directorate (DIRESACallao). Methods: Adescriptive study was performed with samples for MODS from patients suspected of TB or followers from health facilities of DIRESACallao, from January 2009 until December 2012, sent to the Regional Reference Laboratory. We identified: (1) subject characteristics (sex, age, treatment history, reason for the assay) and (2) pre analyticalcharacteristics (time of receipt at the Reference Laboratory, sample quality, refrigerated sample, appropriate containers, correct labeling, correctly filled application). Results: We worked with 25 356 samples for MODS in the study period.Monthly samples show an increasing trend in 2009 and in the second half of 2012. The characteristics of the subjects were:age 39,2±19.4 years and 59,8 % males. 15 091 (59,5%) were never treated and 5 149 (20,3%) were relapses. The time ofreceipt of sample to the reference lab was 3,8±3,4 days, 55,1 % was 3 days. Only 66% of the samples received wereadequate. Regarding the quality of the sample: 96,9% refrigerated, 97,6% had appropriate containers, 94,3% was properly labeled and only 43,6% completed the application correctly. Conclussions: About half of MODS samples from health care centers of DIRESA Callao in four years have limitations in terms of quality of the sample and data collection applications,processes that can be corrected to better manage patients and have valid information on the surveillance of multidrugresistant tuberculosis in DIRESACallao.