Mitochondrial ATPase activity and membrane fluidity changes in rat liver in response to intoxication with Buckthorn (Karwinskia humboldtiana)

BACKGROUND: Karwinskia humboldtiana (Kh) is a poisonous plant of the rhamnacea family. To elucidate some of the subcellular effects of Kh toxicity, membrane fluidity and ATPase activities as hydrolytic and as proton-pumping activity were assessed in rat liver submitochondrial particles. Rats were randomly assigned into control non-treated group and groups that received 1,1.5 and 2 g/Kg body weight of dry powder of Kh fruit, respectively. Rats were euthanized at day 1 and 7 after treatment. RESULTS: Rats under Kh treatment at all dose levels tested, does not developed any neurologic symptoms. However, we detected alterations in membrane fluidity and ATPase activity. Lower dose of Kh on day 1 after treatment induced higher mitochondrial membrane fluidity than control group. This change was strongly correlated with increased ATPase activity and pH gradient driven by ATP hydrolysis. On the other hand, membrane fluidity was hardly affected on day 7 after treatment with Kh. Surprisingly, the pH gradient driven by ATPase activity was significantly higher than controls despite an diminution of the hydrolytic activity of ATPase. CONCLUSIONS: The changes in ATPase activity and pH gradient driven by ATPase activity suggest an adaptive condition whereby the fluidity of the membrane is altered.

Células cebadas en pulmón y nervio periférico en la intoxicación crónica con karwinskia humboldtiana en rata wistar: estudios histológico e histoquímico / Lung and peripheral nerve mast cells in chronic intoxication with karwinskia humboldtiana in wistar rat: histological and histochemical studies

Karwinskia humboldtiana (Kh) es un arbusto venenoso responsable de numerosos casos de intoxicación accidental en humanos. En estudios previos en nuestro laboratorio reportamos un incremento de células cebadas en nervio periférico (NP) durante la intoxicación con Kh, este hallazgo no ha sido reportado previamente en otros órganos durante esta intoxicación por lo que en el presente estudio buscamos la presencia de estas células en otros órganos, además de distinguir subpoblaciones de células cebadas mediante reacciones histoquímicas para la identificación de los gránulos de secreción. El objetivo de este estudio fue evaluar la presencia de células cebadas en órganos distintos al NP y diferenciar histoquímicamente la composición de sus gránulos. Se utilizaron 32 ratas Wistar, se dividieron en cuatro grupos (n= 8) en donde 5 ratas de cada grupo fueron intoxicadas y 3 fueron control no intoxicadas. A las ratas intoxicadas se les administraron por vía oral 3,5 g/kg del fruto seco y molido de Kh fraccionados en 5 dosis de 1,5; 0,5, 0,5; 0,5 y 0,5 g/kg los días 0, 3, 7, 10 y 14 respectivamente. Las ratas control solo recibieron agua. Cada grupo fue sacrificado a diferentes tiempos según la evolución de la parálisis. Se obtuvieron muestras de Hígado, Riñón, Pulmón y SNP, se procesaron hasta obtener bloques de parafina, se obtuvieron cortes y se tiñeron con azul de toluidina, PAS, Azul alciano/PAS y Azul alciano/Safranina. Se identificó la presencia de células cebadas en NP y pulmón con la tinción de azul de toluidina y se realizo un estudio morfométrico observando un incremento progresivo del número de células cebadas por grupo así como variaciones histoquímicas en sus gránulos en cada etapa y órgano analizado, lo que sugiere la participación de las células cebadas y sus secreciones en cada una de las etapas de la intoxicación crónica con el fruto maduro de Kh.

Karwinskia humboldtiana (Kh) is a poisonous shrub causing a number of accidental intoxications in humans. In previous studies in our laboratory, we reported an increased number of mast cells present in peripheral nerve of Kh intoxicated rats. This finding has not been reported in other organs of intoxicated animals. For this reason, in the present study we searched for mast cells in several organs, identifying mast cell subpopulations on the basis of different histochemical reactivity of their secretory granules. Thus the objective of the present study was to evaluate the presence of mast cells in organs other than peripheral nerve and, to distinguish mast cells by their granule content, applying histochemical reactions. 32 Wistar rats were divided into 4 groups (n=8). For each group, 5 rats were intoxicated with Kh and 3 received water only as a control.Intoxicated rats received 3.5 g/ Kg body weight of dry powder of Kh fruits, fractionated in 5 doses as follows 1.5, 0.5, 0.5, 0.5, 05 on days 0, 3,7,10,14 respectively. Control rats received water only. Each group was killed at different times during paralysis evolution. Samples of liver, kidney, lung and brain, were obtained and processed by routine technique until paraffin embedding. Sections were obtained and stained with toluidine blue, PAS, alcian blue/PAS and alcian blue/safranin. Mast cells infiltrates were observed in peripheral nerve and lung. Mast cells were counted. An increasing number of mast cells were recorded as well as variations in the histochemical pattern of their granules for each organ. These findings suggest a role for mast cells and their secretions in the intoxication with mature fruit of Kh.

Intoxicación crónica con el fruto maduro de karwinskia humboldtiana en ratas wistar: daño renal / Chronic intoxication with ripe fruit of karwinskia humboldtiana in wistar rats: renal damage

Karwinskia humboldtiana (Kh) es un arbusto venenoso responsable de numerosos casos de intoxicación accidental en humanos. En la literatura se ha descrito a la intoxicación crónica con Kh como uno polineuropatía sin describir si existen o no alteraciones en órganos distintos al SNC y SNP como lo es el riñón. El objetivo de este estudio fue evaluar la morfología renal en un modelo de intoxicación crónica con Kh. Se utilizaron 32 ratas Wistar, se dividieron en cuatro grupos (n=8) en donde 5 ratas de cada grupo fueron intoxicadas y 3 fueron control no intoxicadas. A las ratas intoxicadas se les administraron por vía oral 3,5 g/kg del fruto seco y molido de Kh fraccionados en 5 dosis de 1,5; 0,5; 0,5; 0,5 y 0,5 g/kg los días 0, 3, 7, 10 y 14 respectivamente. Las ratas control solo recibieron agua. Cada grupo fue sacrificado a diferentes tiempos según la evolución de la parálisis. Se obtuvieron muestras de riñón, se procesaron hasta obtener bloques de parafina y resinas epóxicas, se obtuvieron cortes y se tiñeron y contrastaron para su observación al microscopio de luz y electrónico de transmisión (MET) respectivamente. A microscopia de luz identificamos congestión vascular, necrosis de los túbulos contorneados y fibrosis de la cápsula de renal, en la etapa de parálisis se realizo un conteo de los glomérulos afectados en las muestras tratadas con Kh, a MET además de los hallazgos previamente descritos se identificó la presencia de abundantes depósitos de matriz extracelular en la membrana basal de la cápsula renal y en la barrera de filtración de todos los grupos intoxicados, siendo más evidentes en el grupo de recuperación, lo que demuestra que la intoxicación crónica con Kh es una intoxicación sistémica y no exclusiva del SNC y SNP.

Karwinskia humboldtiana (Kh) is a poisonous shrub causing a number a accidental intoxications in humans. In previous studies, damage has been reported to Peripheral and Central Nervous System. Main intoxication sign is the presence of paralysis. However, no studies have been documented about damage to other organs like the kidney. The objective of this research is to evaluate kidney histology during chronic intoxication. Thirty two (32) Wistar rats were divided into 4 groups (n=8). For each group, 5 rats were intoxicated with Kh and 3 received water only as a control. Intoxicated rats received 3.5 g/Kg body weight of dry powder of Kh fruit, fractionated in 5 doses as follows 1.5, 0.5, 0.5, 0.5, 05 on days 0, 3, 7, 10 and 14 respectively. Control rats received water only. Each group was euthanized at different times during paralysis evolution. Samples of kidney were obtained and processed by routine technique until paraffin embedding for light microscopy studies, and in epoxy resins for transmission electron microscopy. Sections were obtained and stained with H&E, Masson's trichrome, and treated for PAS with diastase reaction to demonstrate basal membranes. At the light microscopic level we observed blood vessel congestion, tubular necrosis and fibrosis of renal capsule. Both at Light microscopy and electron microscopy, it was identified a thickening of the filtration barrier and of renal capsule, in all intoxicated animals, especially in the recovery group. These findings demonstrate that Kh causes a systemic intoxication and not only of the nervous system, as has been considered up to now.

Evaluación del efecto del tratamiento con ácido lipoico administrado a la rata Wistar intoxicada con el fruto de Karwinskia humboldtiana / Evaluation of the effect of treatment with lipoic acid administered to the Wistar rat intoxicated with the fruit of Karwinskia humboldtiana

La ingesta accidental de fruto de Karwinskia humboldtiana ocasiona una parálisis flácida, simétrica, progresiva y ascendente, similar al síndrome de Guillain-Barré. Evoluciona en el transcurso de 3 a 12 meses hasta su recuperación total, pero los casos graves terminan en la muerte por insuficiencia respiratoria. No existe un tratamiento específico. La lesión histopatológica descrita en nervio periférico de pacientes, y animales de experimentación corresponde a una desmielinización segmentaria acompañada de degeneración Walleriana. Una de las toxinas extraídas a partir de la semilla, la T-514, ocasiona un incremento de radicales libres in vitro. Los radicales libres se han relacionado con la desmielinización que se presenta en otros tipos de neuropatías como en la diabética. Ya que la lesión ultraestructural que se presenta en los modelos animales de diabetes es similar a la que se observa en la intoxicación experimental con fruto de K. humboldtiana, se decidió administrar un potente agente antioxidante, el ácido a-lipoico en un modelo de intoxicación crónica por fruto de K. humboldtiana. Sin embargo, no se observó mejoría sobre las manifestaciones clínicas evaluadas en los animales o sobre las lesiones histopatológicas presentes en el nervio periférico. Estos resultados sugieren que los radicales libres no son el mecanismo principal de lesión sobre el nervio periférico en la polineuropatía causada por K. humboldtiana.

The accidental ingestion of Karwinskia humboldtiana causes a flaccid, symmetrical, progressive and ascending paralysis, similar to Guillain-Barre syndrome. It evolves over the course of 3 to 12 months until full recovery, but severe cases end in death due to respiratory failure. There is no specific treatment. The histopathological lesions described in peripheral nerve of patients and in experimental animals, corresponds to segmental demyelination accompanied by Wallerian degeneration. One of the toxins extracted from the seed, T-514, causes an increase of free radicals in vitro. Free radicals have been associated to demyelination that occurs in other types of neuropathy such as diabetic neuropathy. Since the ultrastructural damage that occurs in animal models of diabetes is similar to that observed in experimental poisoning with the fruit of K. humboldtiana, we decided to administer a powerful antioxidant, a-lipoic acid, in a model of chronic poisoning due of K. humboldtiana. However, no improvement was observed on the clinical manifestations evaluated in animals or in the histopathological lesions in the peripheral nerve. These results suggest that free radicals are not the primary mechanism of injury on the peripheral nerve caused by K. humboldtiana.