RESUMO
Interferons with different functions such as antiviral, antiproliferative and immunomodulatory actions are effective medications for a number of diseases. One of these new interferons [IFNs] is Interleukin-29 [IL-29] belongs to the family of IFN-lamda has antiviral activity and its potent in accompanying with IFN-alpha in treatment of HCV infection has been evaluated [clinical trial phase II]. Recombinant IL-29 has been previously produced in multiple expression systems but in this study we cloned and expressed this protein in an Iranian Lizard leishmania [I.L.L] for the first time. The Main objective of this research was to evaluate expression of functional human IL-29 in domestic Lizard leishmania as an alternative eukaryotic expression system. The IL-29 expression cassette was constructed into a pLEXSY vector. The leishmania cells were transfected by electroporation. After selection of transfectants, the protein expression was evaluated at RNA and protein levels. Expression cassette was successfully transfected to leishmania cells and expression of recombinant IL-29 was proved by RT-PCR and western blotting. Purified protein showed 20% activity compared to standard protein. Enzymatic removal of N-glycan resulted to the shift of protein mobility on SDS-PAGE. Easy handling and culture of this eukaryotic host and mammalian cell like posttranslational modifications are the main advantages of this expression host, but the expression yield of this protein is very low and it seems to be not economic for large-scale production.
Assuntos
Humanos , Animais , Interleucinas/genética , Interferons , Leishmaniose/genética , Lagartos , PesquisaRESUMO
O LPG apresenta variações estruturais que são importantes para os diferentes estágios de desenvolvimento do parasito. Nas formas procíclicas, o LPG de L. braziliensis (cepa M2903), não apresenta cadeias laterais enquanto um a dois resíduos de β-glicose podem aparecer nas unidades repetitivas da forma metacíclica. O LPG de L. infantum (cepa BH46), apresenta até três cadeias laterais de glicoses nas unidades repetitivas da forma procíclica e ainda não foi caracterizado nas formas metacíclicas. Esses polimorfismos nas unidades repetitivas do LPG e seu papel na interação com o hospedeiro vertebrado e invertebrado já foram amplamente estudados, sobretudo, para as espécies do Velho Mundo. Entretanto, para a maioria das espécies do Novo Mundo, o papel desses polimorfismos no perfil imunopatológico da doença é ainda desconhecido. Este projeto teve como objetivo avaliar o estudo da interação entre os LPGs de duas espécies epidemiologicamente importantes no Brasil e macrófagos murinos. Estas incluem L. braziliensis e L. infantum, responsáveis pela forma cutânea e visceral, respectivamente.
Neste estudo, os macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c, C57BL/6 e C57BL/6 knock-out (TLR2 -/- e TLR4 -/-), foram primados com IFN- e estimulados com LPG de ambas as espécies. A produção de citocinas (IL-1β, IL-2; IL-4, IL-6, IL-10, IL-12p40, IFN- e TNF-α) foi determinada por citometria de fluxo e a concentração de nitrito pelo método de Griess. A ativação de ERK e p38 foi avaliada por Western blot. Os macrófagos estimulados com LPG de L. braziliensis, apresentaram uma maior produção de TNF-α, IL-1β, IL-6 e NO em comparação aos estimulados com LPG de L. infantum. Também foi observada uma cinética de ativação diferencial das MAPK entre os LPGs. Leishmania infantum apresentou uma ativação constante até 45 minutos após estimulação, enquanto L. braziliensis apresentou um único pico de ativação após 15 minutos. Estes dados sugerem que variações interespecíficas no LPG de Leishmania podem ter um papel importante nos eventos iniciais do compartimento imune inato do hospedeiro
Assuntos
Animais , Cobaias , Camundongos , Leishmania/parasitologia , Leishmaniose/genética , Polimorfismo Genético/genéticaRESUMO
O LPG apresenta variações estruturais que são importantes para os diferentes estágios de desenvolvimento do parasito. Nas formas procíclicas, o LPG de L. braziliensis (cepa M2903), não apresenta cadeias laterais enquanto um a dois resíduos de β-glicose podem aparecer nas unidades repetitivas da forma metacíclica. O LPG de L. infantum (cepa BH46), apresenta até três cadeias laterais de glicoses nas unidades repetitivas da forma procíclica e ainda não foi caracterizado nas formas metacíclicas. Esses polimorfismos nas unidades repetitivas do LPG e seu papel na interação com o hospedeiro vertebrado e invertebrado já foram amplamente estudados, sobretudo, para as espécies do Velho Mundo. Entretanto, para a maioria das espécies do Novo Mundo, o papel desses polimorfismos no perfil imunopatológico da doença é ainda desconhecido. Este projeto teve como objetivo avaliar o estudo da interação entre os LPGs de duas espécies epidemiologicamente importantes no Brasil e macrófagos murinos. Estas incluem L. braziliensis e L. infantum, responsáveis pela forma cutânea e visceral, respectivamente.
Neste estudo, os macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c, C57BL/6 e C57BL/6 knock-out (TLR2 -/- e TLR4 -/-), foram primados com IFN- e estimulados com LPG de ambas as espécies. A produção de citocinas (IL-1β, IL-2; IL-4, IL-6, IL-10, IL-12p40, IFN- e TNF-α) foi determinada por citometria de fluxo e a concentração de nitrito pelo método de Griess. A ativação de ERK e p38 foi avaliada por Western blot. Os macrófagos estimulados com LPG de L. braziliensis, apresentaram uma maior produção de TNF-α, IL-1β, IL-6 e NO em comparação aos estimulados com LPG de L. infantum. Também foi observada uma cinética de ativação diferencial das MAPK entre os LPGs. Leishmania infantum apresentou uma ativação constante até 45 minutos após estimulação, enquanto L. braziliensis apresentou um único pico de ativação após 15 minutos. Estes dados sugerem que variações interespecíficas no LPG de Leishmania podem ter um papel importante nos eventos iniciais do compartimento imune inato do hospedeiro
Assuntos
Animais , Cobaias , Camundongos , Leishmania/parasitologia , Leishmaniose/genética , Polimorfismo Genético/genéticaRESUMO
BACKGROUND: In the pre-microbiological era, it was widely accepted that diseases, today known to be infectious, were hereditary. With the discovery of microorganisms and their role in the pathogenesis of several diseases, it was suggested that exposure to the pathogen was enough to explain infection. Nowadays, it is clear that infection is the result of a complex interplay between pathogen and host, therefore dependant on the genetic make-up of the two organisms. Dermatology offers several examples of infectious diseases in different stages of understanding of their molecular basis. In this review, we summarize the main advances towards dissecting the genetic component controlling human susceptibility to infectious diseases of interest in dermatology. Widely investigated diseases such as leprosy and leishmaniasis are discussed from the genetic perspective of both host and pathogen. Others, such as rare mycobacterioses, fungal infections and syphilis, are presented as good opportunities for research in the field of genetics of infection.
INTRODUÇÃO: Durante a era pré-microbiológica, era comum a visão de que doenças, hoje sabidamente infecciosas, eram hereditárias. Com a descoberta dos microorganismos e seu papel na patogênese de diversas patologias, chegou-se a propor que a exposição ao patógeno era condição suficiente para explicar infecção. Hoje, está claro que infecção é o resultado de uma complexa interação entre patógeno e hospedeiro, dependendo portanto, em última análise, do make-up genético de ambos os organismos. A dermatologia oferece diversos exemplos de doenças infecciosas em diferentes graus de entendimento de suas bases moleculares. Nesta revisão, resumimos os principais avanços na direção da dissecção do componente genético controlando suscetibilidade do ser humano a doenças infecciosas de importância na dermatologia. Doenças amplamente estudadas, como a hanseníase e a leishmaniose, são discutidas sob o ponto de vista da genética tanto do hospedeiro quanto do patógeno. Outras, como micobacterioses raras, micoses e sífilis, são apresentadas como boas oportunidades para pesquisa na área de genética de infecção.
Assuntos
Humanos , Predisposição Genética para Doença/genética , Interações Hospedeiro-Patógeno/genética , Dermatopatias Infecciosas/genética , Histoplasmose/genética , Leishmania/genética , Leishmaniose/genética , Hanseníase/genética , Mycobacterium leprae/genética , Paracoccidioidomicose/genética , Fatores de Risco , Sífilis Cutânea/genética , Tuberculose Cutânea/genéticaRESUMO
Proteínas são compostas por uma ou mais cadeias de aminoácidos e exibem vários níveis de organização estrutural. Recentemente, uma classe de proteínas conhecidas como IUPs (Intrinsically Unstructured Proteins) foi descoberta e sua principal característica é a ausência de estrutura parcial ou total em seu estado nativo. Devido à sua adaptabilidade intrínseca, tais proteínas participam em muitos. processos biológicos regulatórios incluindo o escape do sistema imune. Utilizando a informação contida no proteoma predito de Leishmania braziliensis, Leishmania major, Leishmania infantum, Trypanosoma cruzi e Trypanosoma brucei, desenvolvemos um pipeline de análise computacional que tem como objetivo a identificação, caracterização e análise de IUPs. Nosso principal objetivo é investigar. as correlações biológicas entre desordem estrutural e as interações parasitohospedeiro.. O pipeline emprega 6 metodologias de predição de desordem, integra informações obtidas através da anotação estrutural e funcional, predição subcelular e o cálculo de propriedades físico-químicas. Como cerne do pipeline de IUPs existe um banco de dados relacional modelado de forma a viabilizar a extração das relações entre as inúmeras variáveis analisadas e gerar os relatórios.
Nossos resultados demonstram que as espécies de Leishmania e Trypanosoma possuem aproximadamente 70% e 55% de IUPs, respectivamente. Nossos resultados indicam que nos tripanosomatídeos os aminoácidos promotores de ordem são: W, Y, F, V, I, L e C e os promotores de desordem são P, Q, E, R e S.. A anotação funcional revelou o enriquecimento dos termos GO: transcription, ribonucleoproteins, RNA metabolic process, protein binding e ribonucleotide binding.. Outra característica é a associação entre o aumento da porcentagem de resíduos desordenados, a localização subcelular e o número de regiões transmembrana. Como resultado da validação experimental feita através de técnicas de eletroforese bidimensional (2D) específicas para identificação de IUPs, 100% dos spots identificados foram preditos in silico.. Até o presente momento este trabalho representa a primeira tentativa de estabelecimento das correlações entre desordem estrutural protéica e função nos tripanosomatídeos. A execução do pipeline pode ser solicitada por instituições acadêmicas através de solicitação no sitio http://iup.cpqrr.fiocruz.br/iup-pipeline.
Assuntos
Humanos , Masculino , Feminino , Doença de Chagas/genética , Leishmania/genética , Leishmaniose/genética , Mapeamento de Interação de Proteínas/métodos , Trypanosoma cruzi/genéticaRESUMO
Proteínas são compostas por uma ou mais cadeias de aminoácidos e exibem vários níveis de organização estrutural. Recentemente, uma classe de proteínas conhecidas como IUPs (Intrinsically Unstructured Proteins) foi descoberta e sua principal característica é a ausência de estrutura parcial ou total em seu estado nativo. Devido à sua adaptabilidade intrínseca, tais proteínas participam em muitos. processos biológicos regulatórios incluindo o escape do sistema imune. Utilizando a informação contida no proteoma predito de Leishmania braziliensis, Leishmania major, Leishmania infantum, Trypanosoma cruzi e Trypanosoma brucei, desenvolvemos um pipeline de análise computacional que tem como objetivo a identificação, caracterização e análise de IUPs. Nosso principal objetivo é investigar. as correlações biológicas entre desordem estrutural e as interações parasitohospedeiro.. O pipeline emprega 6 metodologias de predição de desordem, integra informações obtidas através da anotação estrutural e funcional, predição subcelular e o cálculo de propriedades físico-químicas. Como cerne do pipeline de IUPs existe um banco de dados relacional modelado de forma a viabilizar a extração das relações entre as inúmeras variáveis analisadas e gerar os relatórios.
Nossos resultados demonstram que as espécies de Leishmania e Trypanosoma possuem aproximadamente 70% e 55% de IUPs, respectivamente. Nossos resultados indicam que nos tripanosomatídeos os aminoácidos promotores de ordem são: W, Y, F, V, I, L e C e os promotores de desordem são P, Q, E, R e S.. A anotação funcional revelou o enriquecimento dos termos GO: transcription, ribonucleoproteins, RNA metabolic process, protein binding e ribonucleotide binding.. Outra característica é a associação entre o aumento da porcentagem de resíduos desordenados, a localização subcelular e o número de regiões transmembrana. Como resultado da validação experimental feita através de técnicas de eletroforese bidimensional (2D) específicas para identificação de IUPs, 100% dos spots identificados foram preditos in silico.. Até o presente momento este trabalho representa a primeira tentativa de estabelecimento das correlações entre desordem estrutural protéica e função nos tripanosomatídeos. A execução do pipeline pode ser solicitada por instituições acadêmicas através de solicitação no sitio http://iup.cpqrr.fiocruz.br/iup-pipeline.
Assuntos
Masculino , Feminino , Humanos , Doença de Chagas/genética , Leishmania/genética , Leishmaniose/genética , Mapeamento de Interação de Proteínas/métodos , Trypanosoma cruzi/genéticaRESUMO
As Leishmanioses são consideradas pela Organização Mundial de Saúde comouma das seis doenças tropicais mais importantes. A ausência de uma forma eficaz decontrole e contenção da doença justifica o desenvolvimento de uma vacina mais eficaz.Por sua vez, o antígeno A2, exclusivamente expresso nas formas amastigotas deLeishmania tem sido considerado um excelente alvo no desenvolvimento deformulações vacinais em fase experimental. Esse trabalho visou à caracterização daresposta imune induzida por diferentes protocolos de vacinação dose e reforço usando,além do MVA-A2, o Adenovírus-A2, AdA2. O MVA é um vírus atenuado, derivado doVírus Vaccínia Ankara, não replicativo em células de mamíferos. Assim, foramavaliadas as respostas celular, por ensaios de ELISPOT e citotoxicidade in vivo,mediante estimulação dos esplenócitos com peptídeos correspondentes aos epítopospara células TCD4+ e TCD8+ na proteína A2 e a resposta humoral, por ELISA. Apenasos animais vacinados com AdA2 + MVAA2 apresentaram níveis elevados de célulasprodutoras de IFNg e níveis de baixos IL-10 e IL-4, sob estimulação com ambos ospeptídeos, nos ensaios de ELISPOT. Da mesma forma, alta porcentagem de lise foiobservada apenas nesse grupo de animais, indicando que esse esquema vacinal foicapaz de induzir a resposta de células T CD8+ e TCD4+. A resposta imune induzidanesse grupo, considerada do tipo Th1, tem sido relacionada à proteção contra ainfecção desafio por diferentes espécies de Leishmania. Nos testes de ELISA, não foiidentificada produção de anticorpos contra o Antígeno Solúvel de Leishmania, SLA, daforma promastigota, em quaisquer grupos vacinais, o que os diferenciou dos animaisinfectados, nos quais a produção foi observada. Isso é importante no diagnóstico doscães domésticos, uma vez que a vacina atual não possibilita essa diferenciação. Nosoutros grupos vacinados, a resposta imune celular será investigada contra a formaíntegra da proteína A2 e SLA da forma amastigota
Assuntos
Animais , Cobaias , Camundongos , Adenovírus Humanos/patogenicidade , Leishmaniose/genética , Guias como Assunto/prevenção & controle , Vacinação/tendências , Vacinas de DNA/genéticaRESUMO
As Leishmanioses são consideradas pela Organização Mundial de Saúde comouma das seis doenças tropicais mais importantes. A ausência de uma forma eficaz decontrole e contenção da doença justifica o desenvolvimento de uma vacina mais eficaz.Por sua vez, o antígeno A2, exclusivamente expresso nas formas amastigotas deLeishmania tem sido considerado um excelente alvo no desenvolvimento deformulações vacinais em fase experimental. Esse trabalho visou à caracterização daresposta imune induzida por diferentes protocolos de vacinação dose e reforço usando,além do MVA-A2, o Adenovírus-A2, AdA2. O MVA é um vírus atenuado, derivado doVírus Vaccínia Ankara, não replicativo em células de mamíferos. Assim, foramavaliadas as respostas celular, por ensaios de ELISPOT e citotoxicidade in vivo,mediante estimulação dos esplenócitos com peptídeos correspondentes aos epítopospara células TCD4+ e TCD8+ na proteína A2 e a resposta humoral, por ELISA. Apenasos animais vacinados com AdA2 + MVAA2 apresentaram níveis elevados de célulasprodutoras de IFNg e níveis de baixos IL-10 e IL-4, sob estimulação com ambos ospeptídeos, nos ensaios de ELISPOT. Da mesma forma, alta porcentagem de lise foiobservada apenas nesse grupo de animais, indicando que esse esquema vacinal foicapaz de induzir a resposta de células T CD8+ e TCD4+. A resposta imune induzidanesse grupo, considerada do tipo Th1, tem sido relacionada à proteção contra ainfecção desafio por diferentes espécies de Leishmania. Nos testes de ELISA, não foiidentificada produção de anticorpos contra o Antígeno Solúvel de Leishmania, SLA, daforma promastigota, em quaisquer grupos vacinais, o que os diferenciou dos animaisinfectados, nos quais a produção foi observada. Isso é importante no diagnóstico doscães domésticos, uma vez que a vacina atual não possibilita essa diferenciação. Nosoutros grupos vacinados, a resposta imune celular será investigada contra a formaíntegra da proteína A2 e SLA da forma amastigota
Assuntos
Animais , Cobaias , Camundongos , Adenovírus Humanos/patogenicidade , Leishmaniose/genética , Guias como Assunto/prevenção & controle , Vacinação/tendências , Vacinas de DNA/genéticaRESUMO
Com o objetivo geral de detectar e tipar leishmania spp, através da técnica da Reação em Cadeia da Polimerase(PCR) associada à hibridização molecular, foram coletadas amostras de sangue e fragmento de pele de roedores silvestres e sinantrópicos, capturados em área de transmissão de leishmaniose tegumentar e visceral, zona rural no município de Araçuaí, Estado de Minas Gerais, Brasil. No período de maio a setembro de 2001, realizou-se um estudo de levantamento da fauna de roedores silvestres e sinantrópicos na comunidade Ponte do Gravatá. Em diferentes ecótopos, foram coletados 62 indivíduos pertencentes a cinco espécies de roedores silvestres (Thrichomys apereoides, Wiedomys pyrrhorhinos, Oryzomys subflavus, Galea spixii, Bolomys lasiurus) e uma espécie de roedor sinantrópica (Rattus rattus). O roedor silvestre Thrichomys apereoides, e a espécie sintrópica Rattus rattus, foram as mais abundantes na área, bem como as que apresentaram o maior índice de detecção de DNA de leishmania. Nas amostras de sangue foi encontrado um percentual de positividade de 23,0 por cento (14/61), superior ao observado nos fragmentos de pele que foi de 6,4 por cento (4/62). A presença de DNA de parasitas pertencentes aos complexos L. braziliensis, L.mexicana e L. donovani foi detectada em diferentes indivíduos de uma mesma espécie de roedor, R.rattus. Foram relatados, o encontro de L. chagasi no roedor silvestre T. apereoides e o primeiro registro de DNA de Leishmania pertencente ao complexo L. mexicana em Wiedomys pyrrhorhinos, um roedor silvestre típico da Caatinga. Demonstrou-se a viabilidade da utilização de sangue em papel filtro para a detecção de DNA de Leishmania e também a eficácia da PCR associada à hibridização nos estudos desta natureza visando o conhecimento de possíveis reservatórios das leishmanioses.
Assuntos
DNA , Leishmaniose/genética , Roedores , Reação em Cadeia da PolimeraseRESUMO
Com o objetivo geral de detectar e tipar leishmania spp, através da técnica da Reação em Cadeia da Polimerase(PCR) associada à hibridização molecular, foram coletadas amostras de sangue e fragmento de pele de roedores silvestres e sinantrópicos, capturados em área de transmissão de leishmaniose tegumentar e visceral, zona rural no município de Araçuaí, Estado de Minas Gerais, Brasil. No período de maio a setembro de 2001, realizou-se um estudo de levantamento da fauna de roedores silvestres e sinantrópicos na comunidade Ponte do Gravatá. Em diferentes ecótopos, foram coletados 62 indivíduos pertencentes a cinco espécies de roedores silvestres (Thrichomys apereoides, Wiedomys pyrrhorhinos, Oryzomys subflavus, Galea spixii, Bolomys lasiurus) e uma espécie de roedor sinantrópica (Rattus rattus). O roedor silvestre Thrichomys apereoides, e a espécie sintrópica Rattus rattus, foram as mais abundantes na área, bem como as que apresentaram o maior índice de detecção de DNA de leishmania. Nas amostras de sangue foi encontrado um percentual de positividade de 23,0 porcento (14/61), superior ao observado nos fragmentos de pele que foi de 6,4 porcento (4/62). A presença de DNA de parasitas pertencentes aos complexos L. braziliensis, L.mexicana e L. donovani foi detectada em diferentes indivíduos de uma mesma espécie de roedor, R.rattus. Foram relatados, o encontro de L.chagasi no roedor silvestre T.apereoides e o primeiro registro de DNA de Leishmania pertencente ao complexo L.mexicana em Wiedomys pyrrhorhinos, um roedor silvestre típico da Caatinga. Demonstrou-se a viabilidade da utilização de sangue em papel filtro para a detecção de DNA de Leishmania e também a eficácia da PCR associada à hibridização nos estudos desta natureza visando o conhecimento de possíveis reservatórios das leishmanioses
Assuntos
DNA , Leishmaniose/genética , Reação em Cadeia da Polimerase , RoedoresRESUMO
The genetic mechanisms involved in the variability of the human response to the infection of some organisms are critically reviewed. For leprosy and leishmaniasis there seems to exist no simple and general mechanism. The Mitsuda reaction, however, seems to be the most important phenotype measuring the human response to M. leprae. Several genes are known to affect the resistance/susceptibility to malaria. Studies on this disease should take into account all of this variability and be particularly cautious regarding the natural history of the population under study in order to establish the relative importance of given genes on a given population subject to a give epidemic. The sole parasitic disease that did not show discrepancies among studies is schistosomiasis, indicating the importance of a single additive gene that, ultimately, acts on the individualïs capacity to build and efficient eosinophilia. Future studies should focus on general mechanisms as well as on explanations of the existent disparities between studies.