Evaluation of different total Leishmania amazonensis antigens for the development of a first-generation vaccine formulated with a Toll-like receptor-3 agonist to prevent cutaneous leishmaniasis

BACKGROUND Unfortunately, no any vaccine against leishmaniasis has been developed for human use. Therefore, a vaccine based on total Leishmania antigens could be a good and economic approach; and there are different methodologies to obtain these antigens. However, it is unknown whether the method to obtain the antigens affects the integrity and immune response caused by them. OBJECTIVES to compare the protein profile and immune response generated by total L. amazonensis antigens (TLA) produced by different methods, as well as to analyse the immune response and protection by a first-generation vaccine formulated with sonicated TLA (sTLA) and polyinosinic:polycytidylic acid [Poly (I:C)]. METHODS TLA were obtained by four different methodologies and their integrity and immune response were evaluated. Finally, sTLA was formulated with Poly (I:C) and their protective immune response was measured. FINDINGS sTLA presented a conserved protein profile and induced a strong immune response. In addition, Poly (I:C) improved the immune response generated by sTLA. Finally, sTLA + Poly (I:C) formulation provided partial protection against L. amazonensis infection. MAIN CONCLUSIONS The protein profile and immune response depend on the methodology used to obtain the antigens. Also, the formulation sTLA + Poly (I:C) provides partial protection against cutaneous leishmaniasis in mice.

Vacunas contra Leishmania / As vacinas contra Leishmania / Vaccines against Leishmania

La leishmaniosis, una enfermedad parasitaria de amplia distribución mundial y endémica en muchas regiones, plantea un gran reto al control epidemiológico debido, por un lado, a la toxicidad cada vez mayor de la quimioterapia y a la resistencia a la misma, y por el otro, a que el control del vector se ha tornado extremadamente difícil porque el insecto se ha generalizado y adaptado a múltiples y diferentes microambientes; de allí que se le dé alta prioridad al desarrollo de estrategias profilácticas costo-efectivas para prevenirla, porque la población más afectada vive en países con economías débiles. El objetivo de esta revisión fue actualizar lo hecho en estrategias de vacunación contra Leishmania. Se resume dicha información para guiar a los profesionales de la salud sobre el adecuado proceder en el control de tan importante endemia mundial...

Leishmaniosis, a parasitic disease of worldwide distribution and endemic in many regions, poses a challenge to epidemiological control due, on the one hand, to the increased toxicity of chemotherapy and resistance to it and, on the other, to the fact that vector control has become extremely difficult because the insect is widespread and has adapted to many different microenvironments. Hence, the high priority given to develop prophylactic measures to prevent this disease, that are cost-effective because the affected population lives mostly in countries with weak economies. The subject of this review was to update what is being done in vaccination strategies against Leishmania. We summarize the information in order to guide health professionals in the adequate control of this important worldwide endemic disease...

A leishmaniose, uma doença parasitária amplamente espalhada por todo o mundo, e endêmica em varias regiões, representa um grande desafio para o controle epidemiológico devido, por um lado, ao aumento da toxicidade da quimioterapia e a resistência ao mesmo, e por outro lado, para que o controle do vetor tornou-se extremamente difícil, porque o inseto tem sido espalhado e adaptado a diversas condições ambientais; dai que se dá alta prioridade para o desenvolvimento e estratégias de profilática eficaz em termos de custos para evitar, pois as pessoas mais afetadas vivem em países com economias frágeis. O objetivo da revisão foi o de atualizar o fato em estratégias de vacinação contra Leishmania. Se Resume essa informação para orientar os profissionais de saúde sobre o procedimento adequado para o controle de uma tão importante endemia mundial...

Effect of different serine protease inhibitors in validating the 115 kDa Leishmania donovani secretory serine protease as chemotherapeutic target.

Proteases have been considered as an important group of targets for development of antiprotozoal drugs due to their essential roles in host-parasite interactions, parasite immune evasion, life cycle transition and pathogenesis of parasitic diseases. The development of potent and selective serine protease inhibitors targeting L. donovani secretory serine protease (pSP) could pave the way to the discovery of potential antileishmanial drugs. Here, we employed different classical serine protease inhibitors (SPIs), such as aprotinin, N-tosyl-l-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK), N-tosyl-lysine chloromethyl ketone (TLCK), benzamidine (Bza) and pSP-antibody to determine the role of the protease in parasitic survival, growth and infectivity. Among the different classical SPIs, aprotinin appeared to be more potent in arresting L. donovani promastigotes growth with significant morphological alterations. Furthermore, aprotinin and anti-pSP treated parasites significantly decreased the intracellular parasites and percentage of infected macrophages. These results suggest that SPIs may reduce the infectivity by targeting the serine protease activity and may prove useful to elucidate defined molecular mechanisms of pSP, as well as for the development of novel antileishmanial drugs in future.

Therapy with radio-attenuated vaccine in experimental murine visceral leishmaniasis showed enhanced T cell and inducible nitric oxide synthase levels, suppressed tumor growth factor-beta production with higher expression of some signaling molecules

Background: Visceral leishmaniasis (VL) or Kala-Azar (KA) is one of the most deadly forms of disease among all neglected tropical diseases. There are no satisfactory drugs or vaccine candidates available for this dreaded disease. Our previous studies showed promising therapeutic and prophylactic efficacy of the live, radio-attenuated parasites through intramuscular (I.M.) and intraperitoneal (I.P.) route in BALB/c mice model. Methods: The T-cell proliferation level, the mRNA expression level of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and tumor growth factor-beta (TGF-β) genes and finally the phosphorylation levels of phosphoinositide dependent kinase 1 (PDK1), phosphoinositide 3 kinase (PI3K) and p38 mitogen activated protein kinase (p38MAPK) molecules were checked in BALB/c mice model immunized with radio-attenuated Leishmania donovani parasites through I.M. route. Results: Higher T-cell proliferation, increased iNOS level, and suppressed TGF-β level were found in treated infected animal groups (100 and 150 Gy) in relation to untreated infected animals. Likewise, phosphorylation levels of PDK1, PI3K and p38MAPK of these two groups were increased when compared to untreated infected controls. Conclusion: The clearance of the parasites from treated infected groups of animals may be mediated by the restoration of T-cell due to therapy with radio-attenuated L. donovani parasites. The killing of parasites was mediated by increase in nitric oxide release through PDK1, PI3K and p38MAPK signaling pathways. A lower TGF-β expression has augmented the restored Th1 ambience in the 100 and 150 Gy treated animal groups proving further the efficacy of the candidate vaccine. .

Avaliação da infecciosidade em cães vacinados com Leish-Tec® (Hertape Saúde Animal S/A) para Lutzomyia longipalpis (Diptera: Psychodidae, Phlebotominae)

O presente trabalho avaliou a transmissibilidade de Leishmania spp. para Lutzomyialongipalpis em 136 cães nativos e beagles-sentinelas, vacinados ou não (placebo) com Leish-Tec® (vacina anti-leishmaniose visceral canina), domiciliados em Porteirinha, município endêmico para leishmaniose visceral, em Minas Gerais. Esses animais foram selecionados a partir da amostra total de cães que compõem o ensaio clínico de fase III que determinou a eficácia da vacina Leish-Tec®, conforme diretrizes estabelecidas pelo Ministério da Saúde do Brasil. Além da técnica de xenodiagnóstico, esses cães também foram submetidos aos testes diagnósticos ELISA, RIFI, teste rápido Kalazar DetectTM e exames de detecção do parasito. Uma tendência de redução da infectividade (p-valor 0,052) foi observada no grupo de cães vacinados com Leish-Tec®que apresentaram resposta sorológica positiva ao antígeno vacinal A2. Os testes RIFI, Kalazar DetectTM e xenodiagnóstico apresentaram maior percentual de positividade entre os cães sintomáticos da amostra (p<0,05), quando comparados aos cães assintomáticos, na análise global.

Na análise estratificada e, para o grupo de cães que recebeu vacina, as diferenças se mantiveram para a RIFI e o teste rápido, mas não para o xenodiagnóstico; já para os cães que receberam placebo, as diferenças entre grupos clínicos se mantiveram para o xenodiagnóstico e teste rápido, mas não para a RIFI. Nossos resultados sugerem que a Leish-Tec® possui potencial de redução da infectividade em cães vacinados e desafiados em área endêmica e que a vacinação com Leish-Tec® pode contribuir para a redução da transmissão da leishmaniose visceral canina, desde que utilizada como medida protetiva individual e em conjunto com as demais estratégias, individuais e coletivas, de prevenção e controle da doença. Com relação à diferença de desempenho dos testes diagnósticos entre grupos clínicos, nossos resultados apontam para a necessidade de desenvolvimento de testes mais eficazes no diagnóstico da infecção assintomática por Leishmania e demonstra que essas diferenças interferem nos resultados e devem ser consideradas na avaliação de ensaios clínicos.

Análise molecular da resposta imune no modelo hamster dourado e avaliação da eficácia da vacina LACK DNA por via intranasal contra infecção por Leishmania (Viannia) braziliensis / Molecular analysis of the immune response in the golden hamster model and evaluating the effectiveness of LACK DNA vaccine intranasally against infection by Leishmania (V. ) braziliensis

Estudos anteriores no modelo murino demonstraram a possibilidade deindução de proteção através da imunização por via mucosa, tanto com antígenosbrutos (lisado total de promastigotas de Leishmania amazonensis - LaAg) comoatravés de vacina de DNA (DNA plasmideal com o gene que codifica a proteínaLACK - LACK DNA), contra a leishmaniose cutânea (LC) causada por L.amazonensis, e a leishmaniose visceral causada por L. infantum. No entanto,estudos de vacinação contra as espécies do subgênero Viannia, principaisresponsáveis pela LC nas Américas, são dificultados devido à falta de modelosexperimentais de fácil manuseio que reproduzam a doença humana. Recentementefoi demonstrado pelo nosso grupo que o hamster dourado é um modelo adequadopara o estudo da imunopatogênese da leishmaniose cutânea causada por L. (V.)braziliensis e que o antígeno LaAg administrado por via intranasal induziu proteçãocontra a infecção por L. (V.) braziliensis no modelo. Entretanto, as abordagensimunológicas e moleculares para os estudos no modelo hamster são limitadas pelapouca disponibilidade de insumos comerciais disponíveis. Nesse trabalho,padronizamos um ensaio por RT-qPCR para avaliação de marcadores molecularesem pele de hamsters infectados por L. braziliensis, pela expressão gênica de IFN-gama,TGF-beta, TNF, IL-10, IL-4, IL-6, iNOS e arginase, e investigamos o efeito protetor daimunização intranasal com a vacina gênica LACK DNA, administrada em protocolosprime-boost homólogo (50mig/dose) e heterólogo (LACK DNA-50mig / LaAg-10mig) nainfecção por L. braziliensis...

Previous studies in murine models demonstrated the possibility to induceprotection by mucosal immunization with crude antigens (total lysate of Leishmaniaamazonensis promastigotes - LaAg) as well as through DNA vaccine (plasmid DNAwith the gene encoding LACK protein - LACK DNA) against cutaneous leishmaniasis(CL) caused by L. amazonensis and visceral leishmaniasis caused by L. infantum.However, vaccination studies against Viannia subgenus (the main cause for CL inAmericas) are hampered due to the lack of experimental models which are easilyexecuted to mimic this disease as it occurs in humans. Recently, it was demonstratedby our group that the golden hamster is an appropriate model to studyimmunopathological aspects of cutaneous leishmaniasis caused by L. (V.)braziliensis. Furthermore, it was also demonstrated that LaAg antigen administeredintranasally induces protection against L. (V.) braziliensis infection in the model.However, immunological and molecular approaches for studies in hamster modelsare limited by the low availability of commercial products. In this study, westandardized an assay by RT-qPCR for assessment of molecular markers in the skinof hamsters infected by L. braziliensis, through the relative gene expressionquantification of IFN-gama, TGF-beta, TNF, IL-10, IL-4, IL-6, iNOS and arginase, and theprotective effect of intranasal immunization with LACK DNA vaccine (administered inhomologous prime-boost protocol 50 mcg/dose) and heterologous prime-boost(LACK DNA 50 mcg in first dose/LaAg-10mg in second dose), against L. braziliensisinfection. The results demonstrated that immunization with LACK DNA homologousprime boost did not induce protection against L. braziliensis infection in hamstermodel since there was no significant difference in lesion size, in parasite load, andIgG and IgG 2 anti-Leishmania levels on day 110 after infection, compared with thecontrol groups (PBS and DNA)...

A mucosa nasal como uma via estratégica de vacinação contra infecção por Leishmania (Viannia) braziliensis no modelo hamster dourado (Mesocricetus auratus) / Nasal mucosa as an estrategic way of vacination against infection by leishmania (Viannia) braziliensis in the golden hamster model

Resultados anteriores demonstraram que a administração oral e intranasal deantígenos brutos de Leishmania (Leishmania) amazonensis (LaAg) protegeparcialmente camundongos contra a infecção por L. amazonensis. No entanto,estudos de vacinação contra as espécies do subgênero Viannia, as principais espécies causadora da leishmaniose cutânea e mucosa nas Américas, têm sido dificultados pela falta de modelos experimentais de fácil manuseio que reproduzam a doença humana. Recentemente, foi demonstrado que o hamster dourado é um modelo adequado para o estudo da imunopatogênese da leishmaniose cutânea causada por L. (Viannia) braziliensis. Usando o modelo hamster, investigamos se o efeito protetor da imunização intranasal com LaAg pode ser estendido a infecção porL. braziliensis. Hamsters foram vacinados com duas doses de LaAg (10 µg)intranasal (IN) ou duas doses de LaAg (20 mig) por via intramuscular (IM) e duas semanas após a vacinação foram desafiados com L. braziliensis. Os resultados demonstraram que a imunização com LaAg reduziu significativamente o crescimento da lesão e da carga parasitária, bem como os níveis de IgG e IgG2 no plasma. No final do experimento, 114 dias após a infecção, os hamsters que foram considerados protegidos expressaram na pele níveis semelhantes de mRNA para IFN-gama e IL-10comparados aos níveis na pele de animais não infectados, diferentemente do observado nos animais não protegidos. Comparando com a via nasal, a imunização pela via intramuscular (IM) não induziu proteção. Estes resultados demonstram pela primeira vez que a imunização pela via nasal pode induzir proteção cruzada contra a infecção por L. braziliensis...

Previous results have shown that oral and intranasal administration of crudeLeishmania (Leishmania) amazonensis antigens (LaAg) partially protects miceagainst L. amazonensis infection. However, vaccination studies on species of thesubgenus Viannia, the main causative species of cutaneous and mucosalleishmaniasis in the Americas, have been hampered by the lack of easy-to-handlebio-models that accurately mimic the human disease. Recently, we demonstratedthat the golden hamster is an appropriate model for studying theimmunopathogenesis of cutaneous leishmaniasis caused by L. (Viannia) braziliensis.Using the golden hamster model, we investigated whether the protective effect ofintranasal immunisation with LaAg can be extended to L. braziliensis infection.Golden hamsters vaccinated with either two intranasal (IN) doses of LaAg (10 µg) ortwo intramuscular doses of LaAg (20 µg) were challenged 2 weeks post-vaccinationwith L. braziliensis. The results showed that IN immunisation with LaAg significantlyreduced lesion growth and parasitic load as well as serum IgG and IgG2 levels. Atthe experimental endpoint on day 114 post-infection, IN-immunised hamsters thatwere considered protected expressed IFN-gama and IL10 mRNA at similar levels asuninfected skin. Unlike what was observed in animals not protected. In contrast to thenasal route, intramuscular (IM) immunisation failed to provide protection. Theseresults demonstrate for the first time that the nasal route of immunisation can inducecross protection against L. braziliensis infection...

Histopathological and immunohistochemical aspects of American cutaneous leishmaniasis before and after different treatments* / Aspectos histopatológicos e imuno-histoquímicos da leishmaniose tegumentar americana antes e depois de diferentes tratamentos

The histopathology and immune responses of the healing process of leishmaniasis are still poorly studied. This study aimed to examine the histopathological and immunological aspects of lesions of patients with cutaneous leishmaniasis before and after different therapeutic methods. We studied 23 individuals grouped according to the treatments: Glucantime, Glucantime + Leishvacin and Glucantime + Leishvacin associated with Bacillus Calmette-Guerin. For analysis of the histopathological changes present in the dermis and epidermis, histological sections were stained with hematoxylin and eosin. The samples were immunostained before and after treatment to analyze the expression of interferon (IFN)-γ, interleukin (IL) 12, IL-10 and IL-4. Before treatment the presence of intense infiltrates of mononuclear cells was noticed and after treatment, even with a diagnosis of clinical cure, the subjects still showed a moderate inflammatory process. In the immunohistochemical analyses, we noticed a difference between the cytokines, with increased expression of cytokines IFN-γ and IL-12 compared to IL 10 and IL-4, both before and after treatment and, comparatively, the difference in this expression was more intense before treatment. However, the cytokine expression analyzed by treatment group showed no statistically significant difference. We conclude that a clinical cure does not always coincide with the histopathological ...

A histopatologia e as respostas imunológicas do processo de cura da leishmaniose são ainda pouco estudadas. Este estudo teve como objetivo avaliar os aspectos histopatológicos e imunológicos das lesões de pacientes com leishmaniose tegumentar, antes e após diferentes métodos terapêuticos. Foram estudados 23 indivíduos agrupados de acordo com os tratamentos: Glucantime, Glucantime + Leishvacin e Glucantime + Leishvacin associado com Bacilo Calmette-Guerin. Para a análise das alterações histopatológicas presentes na derme e epiderme, cortes histológicos foram corados com hematoxilina e eosina. Para avaliar a expressão de interferon (IFN)-γ, interleucina (IL) 12, IL-10 e IL-4 foi utilizada a técnica de imuno-histoquímica antes e após o tratamento. Antes do tratamento houve um intenso infiltrado de células mononucleares, após o tratamento, mesmo com um diagnóstico de cura clínica, apresentou-se ainda um moderado processo inflamatório. Na análise imuno-histoquímica, notamos uma diferença entre as citocinas, com expressão aumentada de citocinas IFN-γ e IL-12 em comparação com IL-10 e IL-4 tanto antes quanto depois do tratamento, e comparativamente, a diferença nesta expressão mostrou-se mais intensa antes do tratamento. No entanto, a expressão das citocinas analisadas por grupo de tratamento não mostraram diferenças ...

Experimental models in vaccine research: malaria and leishmaniasis

Animal models have a long history of being useful tools, not only to test and select vaccines, but also to help understand the elaborate details of the immune response that follows infection. Different models have been extensively used to investigate putative immunological correlates of protection against parasitic diseases that are important to reach a successful vaccine. The greatest challenge has been the improvement and adaptation of these models to reflect the reality of human disease and the screening of vaccine candidates capable of overcoming the challenge of natural transmission. This review will discuss the advantages and challenges of using experimental animal models for vaccine development and how the knowledge achieved can be extrapolated to human disease by looking into two important parasitic diseases: malaria and leishmaniasis.

Avaliação das histonas de L. infantum como candidatos à vacinas na infecção por l.infantum em hamsters / Evaluation of histones from L. infantum as candidate vaccines in infection in hamsters l.infantum

A leishmaniose visceral é uma doença infecciosa grave, causada por protozoários intracelulares obrigatórios do gênero Leishmania. Vários antígenos de Leishmania têm sido avaliados como candidatos vacinais, destacando-se as proteínas de histonas (HIS), antígenos altamente conservados. A exposição de HIS pela Leishmania induz uma resposta imune potente no hospedeiro vertebrado. Desse modo, neste estudo, avaliamos, em hamsters, a capacidade imunoprotetora dos antígenos de histonas contra a infecção por Leishmania infantum. Os animais foram vacinados com estratégia homóloga, utilizando-se plasmídeos de DNA que codificam para HIS (pcDNA3LiH2A-H3, pcDNA3LiH2B-H4) ou heteróloga (DNA/proteínas HIS) mais 1nM de CpG. Quinze dias após a última imunização, os animais foram desafiados pela via intradérmica com 105 Leishmania infantum metacíclicas mais 0,5 par de glândula salivar de Lutzomya longipalpis. Após a última imunização e durante a infecção, realizaram-se dosagens de citocinas por PCR em tempo real (linfonodo e baço), sorologia por ELISA (soro), carga parasitária por diluição limitante e análise histopatológica de tecidos (linfonodo, baço e fígado). Detectou-se produção de anticorpos IgG anti HIS nos grupos imunizados com a estratégia homóloga e heteróloga, quando comparados aos hamsters não imunizados. As imunizações homóloga e heteróloga diferiram na razão IFN-γ/IL-10 no linfonodo em relação ao grupo controle. Não houve diferença significativa na expressão dessas citocinas no baço após a imunização, entretanto, cinco meses após o desafio o grupo homólogo apresentou um aumento na produção de IL-10 nesse órgão. Na análise histopatológica do baço, verificou-se formação de mais folículos com centro germinativo, evidentes nos animais imunizados independentemente do grupo analisado. Observou-se, também, leucocitose intrasinusoidal e periportal no fígado, e folículos reativos no linfonodo. Nenhuma das estratégias de imunizações com antígenos de histonas acarretou em diminuição da carga parasitária no linfonodo, baço e fígado. As estratégias de imunização homóloga e heteróloga, com antígenos de histonas nucleossomais, não foram capazes de proteger contra infecção por L. infantum no modelo do hamster.

The use of conjunctival swab samples for PCR screening for visceral leishmaniasis in vaccinated dogs / O uso de amostras de swab conjuntival para triagem por PCR da leishmaniose visceral em cães vacinados

The polymerase chain reaction (PCR) has been shown to provide a rapid and sensitive technique for Leishmania detection. The aim of this study was to evaluate the technique of noninvasive conjunctival swabs (CS) as a sampling method for molecular screening for visceral leishmaniasis (VL) in a group of 42 police dogs, all of them vaccinated against VL, and to compare the results with those obtained by serological tests. The serological assays were performed independently by three laboratories. Laboratories 1 and 2 were private laboratories and laboratory 3 was the National Reference Laboratory. The first serological screening performed by laboratory 1 showed 15 reactive dogs and 4 indeterminate. Laboratory 2 confirmed only 3 reactive dogs and 2 indeterminate. Laboratory 3 confirmed 7 reactive dogs and 3 indeterminate. The PCR diagnosis using the CS procedure was performed on all 42 animals and was able to detect Leishmania DNA in 17 dogs. The PCR assay confirmed all the cases that were simultaneously reactive in the serological tests by two laboratories. The results showed that the CS technique was a sensitive and practical method for sample collection, thus allowing reliable diagnostic tests through PCR.

A PCR (do inglês Polymerase Chain Reaction) tem demonstrado ser uma técnica rápida e sensível para detecção de Leishmania. O objetivo deste estudo foi avaliar a técnica não invasiva do swab conjuntival na identificação por PCR de animais infectados em um grupo de 42 cães policiais, todos vacinados contra a Leishmaniose Visceral (VL), e comparar os resultados com aqueles obtidos pelos testes sorológicos. Os ensaios sorológicos foram realizados independentemente por três laboratórios. Os laboratórios 1 e 2 eram privados. O laboratório 3 era o Laboratório de Referência Nacional. A primeira triagem sorológica realizada pelo laboratório 1 apresentou 15 cães reativos e 4 indeterminados. O laboratório 2 confirmou apenas 3 cães reativos e 2 animais indeterminados. O laboratório 3 confirmou 7 cães reativos e 3 cães foram classificados como indeterminados. O diagnóstico pela PCR, utilizando o procedimento do swab conjuntival, foi realizado em todos os 42 animais e foi capaz de detectar DNA de Leishmania em 17 cães. A PCR confirmou todos os casos simultaneamente reativos nos testes sorológicos de dois laboratórios. Os resultados demonstraram que o swab conjuntival é um método sensível e prático para coleta de amostra, permitindo um diagnóstico consistente através da PCR.

Leishmania mexicana Gp63 cDNA using gene gun induced higher immunity to L. mexicana infection compared to soluble leishmania antigen in BALB/C

Leishmaniasis is a worldwide disease prevalent in tropical and sub tropical countries. Many attempts have been made and different strategies have been approached to develop a potent vaccine against Leishmania. DNA immunisation is a method, which is shown to be effective in Leishmania vaccination. Leishmania Soluble Antigen [SLA] has also recently been used Leishmania vaccination. The immunity generated by SLA and L. mexicana gp63 cDNA was compared in groups of 6 mice, which were statistically analysed by student t- test with the P-value of 0.05. SLA was administered by two different methods; intramuscular injection and injection of dendritic cells [DCs] loaded with SLA. L. mexicana gp63 cDNA was administered by the gene gun. Immunisation of BALB/c mice with L. mexicana gp63 resulted in high levels of Th1- type immune response and cytotoxic T lymphocytes [CTL] activity, which were accompanied with protection induced by the immunisation against L. mexicana infection. In contrast, administration of SLA, produced a mixed Th1/Th2-type immune responses as well as a high level of CTL activity but did not protect mice from the infection. The results indicate higher protection by DNA immunisation using L. mexicana gp63 cDNA compared to SLA, which is accompanied by a high level of Th1 immune response. However, the CTL activity does not necessarily correlate with the protection induced by the vaccine. Also, gene gun immunisation is a potential approach in Leishmania vaccination. These findings would be helpful in opening new windows in Leishmania vaccine research

Imunização de camundongos com fragmentos recombinantes de cinesina de Leishmania chagasi e/ou plasmídeos codificando Il-12 e IL-2 murinas / Immunization of mice with recombinant fragments of Leishmania chagasi kinesin and/or plasmids encoding IL-12 and IL-2 murine

Leishmaniose visceral zoonótica (LV) é uma doença que afeta homens e cães e é causada por protozoários das espécies Leishmania infantum e Leishmania chagasi. O cão doméstico é o principal reservatório do agente causal. Uma vacina efetiva contra a LV canina poderá contribuir para o controle da infecção e/ou doença humana e canina. A resposta imune protetora contra a LV canina é do tipo celular (Th1). Em nosso laboratório, dentre um grupo de cinco antígenos ecombinantes selecionados de uma biblioteca de cDNA de L. chagasi, usando-se uma mistura de soro de cães naturalmente infectados e que exibiam resposta imune humoral e celular específica, um fragmento da extremidade carboxila de uma cinesina com cauda de 6 histidinas (rLci2B-NH6), para permitir a purificação, foi escolhido para a avaliação do seu potencial como candidato a componente de uma vacina contra LV canina. No presente trabalho foi avaliada a imunização de camundongos BALB/c com rLci2BNH6/ saponina em associação com os plasmídeos pcDNA3.1-scmu-IL-12 e/ou pcDNA3.1-mu-IL-2. Os animais imunizados com rLci2B-NH6/saponina em associação com a IL-12 e/ou IL-2 produziram anticorpos IgG, IgG2a e IgG1 específicos. Esplenócitos desses animais exibiram proliferação, mas não produziram IFN-γ ou IL-5 após estimulação in vitro com rLci2B-NH6. Esses resultados sugerem que a adição de pcDNA3.1-mu-IL-2 no protocolo de imunização não é capaz de promover uma resposta imune predominantemente Th1. Também foi avaliada a imunização de camundongos com proteína recombinante quimérica (rLci2-NTCT-NH6) formada pelos domínios não repetitivos presentes nas extremidades amina e carboxila codificadas pelo gene da cinesina. Camundongos BALB/c imunizados com rLci2- NT-CT-NH6 ou uma proteína recombinante químerica controle, contendo 5 domínios repetitivos presentes em rLci2B-NH6 entre os domínios não repetitivos de rLci2-NT-CTNH6, apresentaram produção de IgG, IgG2a e IgG1. Esplenócitos desses animais exibiram proliferação, mas não produziram IFN-γ e apenas esplenócitos dos camundongos imunizados com rLci2-NT-5R-CT-NH6 sintetizaram IL-5, após estimulação in vitro com as respectivas proteínas. Contudo, durante a purificação de rLci2-NT-CT-NH6 e rLci2-NT-5R-CT-NH6 ocorreu intensa proteólise que pode ter resultado na destruição de epítopos capazes de induzir resposta Th1. Previamente, em nosso laboratório, foi observada a morte de alguns camundongos injetados com 100 μg saponina/dose, por isso, doses menores de saponina (50 ou 25 μg) foram avaliadas como adjuvante na indução de resposta imune a rLci2B-NH6. Os resultados da mensuração dos anticorpos foram semelhantes nos três grupos. Curiosamente, somente esplenócitos do grupo injetado com 25 μg/dose exibiram proliferação específica. O grupo injetado com 100 μg/dose produziu IFN-γ e IL-5 e o grupo injetado com 50 μg/dose sintetizou IFN-γ, mas não produziu IL-5, após estimulação in vitro com rLci2B-NH6.

Avaliação da resposta imune em camundongos utilizando diferentes protocolos de imunização com antígenos recombinantes de Leishmania chagasi / Evaluation of immune response in mice using different protocols of immunization with recombinant antigens of Leishmania chagasi

A leishmaniose visceral é uma doença parasitária causada por Leishmania chagasi. Os cães são considerados como principais reservatórios do parasito. Uma vacina efetiva para o cão pode contribuir para o controle da LV tanto no homem como no cão. Em um estudo prévio, antígenos recombinantes, obtidos a partir de uma biblioteca de cDNA da forma amastigota de Leishmania chagasi, foram selecionados a fim de serem avaliados como candidatos a componente de uma vacina contra leishmaniose visceral canina. No presente trabalho, a resposta imune humoral e celular de camundongos foi avaliada após injeção de alguns desses antígenos recombinantes, em cinco diferentes protocolos de imunização. Grupos de camundongos BALB/c foram injetados com as proteínas rLci4A-NH6 ou rLci2B-NH6, isoladamente ou associadas aos adjuvantes saponina, ODN 1826 ou diferentes doses de um plasmídeo codificando IL-12 murina. Além disso, animais foram sensibilizados com plasmídeo codificando Lci2B e receberam reforço com a proteína rLci2B-NH6 associada à saponina. Por último, os animais foram injetados com plasmídeos codificando novos antígenos, Lci2-NT-5R-CT ou Lci2-NT-CT, e recebram reforço com as respectivas proteínas recombinantes rLci2-NT-5R-CT-NH6 ou rLci2-NT-CT-NH6 associadas à saponina. Nesse último protocolo, os plasmídeos utilizados continham o gene para uma proteína transmembrana associada a lisossomos, LAMP, visando à produção in vivo de quimeras de dos antígenos de Leishmania com LAMP, a fim de direcionar a apresentação dos peptídeos para linfócitos T CD4+ via moléculas de MHC-II. Em um dos protocolos, os animais foram desafiados com 1 x 107 Leishmanias para avaliação da carga parasitária no baço após imunização. Os resultados encontrados mostraram que animais que receberam rLci4A-NH6, isoladamente ou com diferentes doses de plasmídeo codificando IL-12, apresentaram níveis signficantes de IgG e IgG1, ao passo que o uso do antígeno com os adjuvantes saponina ou ODN 1826 induziu a produção de IgG, IgG2a e IgG1, além de produção de IL-5 pelo grupo que recebeu saponina. Animais que receberam rLci2B-NH6, isoladamente ou associado aos plasmídeos contendo inserto de IL-12, produziram IgG e IgG1 antígeno específicos e falharam também na produção de citocinas e proliferação celular. A utilização de saponina com esse antígeno induziu produção de IgG, IgG2a e IgG1, assim como de IFN-γ. Já o uso de ODN 1826, induziu a produção de IgG e IgG1, favoreceu a produção de IgG2a, mas falhou na indução de resposta imune celular significante. Por outro lado, animais que receberam plasmídeo codificando Lci2B e reforço com a proteína associada à saponina apresentaram uma resposta imune com predominância de anticorpos IgG2a e produção de IFN-γ por alguns animais, a qual não conferiu proteção contra infecção pelo parasito. Por fim, a utilização de quimeras de LAMP/Lci2-NT-5R-CT ou LAMP/Lci2-5R-CT induziu uma fraca resposta imune humoral, com produção de IgG, IgG1 e IgG2a por alguns animais. No entanto, a utilização da quimera LAMP/Lci2-NT-CT induziu proliferação celular e tendência a produção de IFN-γ. Em conclusão, nenhum dos cinco protocolos utilizados foi capaz de induzir uma resposta imune específica predominantemente celular do tipo Th1 ou capaz de conferir proteção contra infecção dos animais.

Avaliação da resposta imune celular desencadeada por antígenos protéicos isolados de Leishmania (Viannia) shawi / Analysis of cellular immune response induced by proteic antigens isolated from Leishmania (Viannia) shawi

A espécie Leishmania (Viannia) shawi foi caracterizada recentemente pelo grupo de Lainson. Estudos recentes indicam o importante papel médico epidemiológico deste parasito no Brasil. Portanto, os objetivos do presente estudo foram caracterizar o modelo experimental murino desta infecção, purificar antígenos protéicos e avaliar seus graus de proteção após desafio. Para caracterizar o modelo murino de infecção, camundongos das linhagens BALB/c e C57BL/6 foram infectados na pata com formas promastigotas e os achados histopatológicos e imunológicos foram avaliados durante a evolução da infecção. Para os estudos de imunização foram utilizados 10 diferentes antígenos: três secretados/excretados pelas formas promastigotas de L. (V.) shawi, dois intracelulares solúveis das formas amastigotas (AgAma) e promastigotas (AgPro), e cinco frações protéicas purificadas a partir do antígeno intracelular solúvel das formas promastigotas. Estes antígenos foram utilizados para imunizar camundongos da linhagem BALB/c duas vezes, subcutaneamente no dorso. Após uma semana da última imunização, os animias foram desafiados com formas promastigotas. O desenvolvimento das lesões nos animais foram acompanhadas por seis ou oito semanas pós desafio (PD), quando os animais foram sacrificados para análise da carga parasitária e dos aspectos relacionados às respostas imune celular e humoral. Camundongos da linhagem BALB/c foram altamente susceptíveis à infecção, uma vez que as mudanças histopatológicas e da imunidade humoral foram mais pronunciadas nos camundongos BALB/c que em C57BL/6. Os antígenos secretados/excretados de baixa massa molecular induziram alta taxa de proteção em comparação aos animais não imunizados, já os antígenos secretados/excretados de média massa molecular protegeram intermediariamente os animais, possivelmente pela alta expressão de IFN-g e IL-4 nos linfócitos T CD8+. AgAma e AgPro tiveram uma resposta antagônica nos animais, pois o AgAma suprimiu a produção de...

Leishmania (Viannia) shawi specie was recently characterized by Lainson group. Currently, studies indicate important medical and epidemiological role of this parasite in Brazil. Therefore, the aims of this study were to characterize the experimental murine model of this infection, purify proteic antigens and evaluate their protection degrees after challenge. To characterize the murine model of infection, BALB/c and C57BL/6 mice were infected in the footpad with promastigote forms, and the histopathological and immunological findings were evaluated during the evolution of infection. For the immunization studies, 10 different antigens were used, as follow: three released/excreted by promastigote forms of L. (V.) shawi; two intracellular soluble antigens from amastigote (AgAma) and promastigote forms (AgPro), and 5 proteic fractions purified from soluble intracellular antigens from promastigote forms. These antigens have been used to immunize BALB/c mice twice, subcutaneously in the rump. After 1 week of last immunization, the animals were challenged. The lesion developments in animals were followed during either six or eight weeks post-challenge (PC), when the animals were sacrificed to evaluate the parasite load and aspects of cellular and humoral immune responses. BALB/c mice were the most susceptible to L. (V.) shawi infection, since the histopathological and humoral changes were higher in BALB/c than C57BL/6 mice. Secreted/excreted antigens of low molecular mass induced high protection rate compared to non-immunized mice, already mice immunized with secreted/released antigens of medium molecular mass showed mild protection, possibly caused by high expression of IFN-g and IL-4 by CD8+ T lymphocytes. AgAma and AgPro showed antagonic response in animals, since AgAma suppressed the IFN-g and IL-12 production, however high level of TGF-b has been detected, allowing the increasing of parasitism in the skin and lymph nodes. In spite of the detection of...

Antigenic extracts of Leishmania braziliensis and Leishmania amazonensis associated with saponin partially protects BALB/c mice against Leishmania chagasi infection by suppressing IL-10 and IL-4 production

This study evaluated two vaccine candidates for their effectiveness in protecting BALB/c mice against Leishmania chagasiinfection. These immunogenic preparations were composed of Leishmania amazonensisor Leishmania braziliensisantigenic extracts in association with saponin adjuvant. Mice were given three subcutaneous doses of one of these vaccine candidates weekly for three weeks and four weeks later challenged with promastigotes of L. chagasiby intravenous injection. We observed that both vaccine candidates induced a significant reduction in the parasite load of the liver, while the L. amazonensisantigenic extract also stimulated a reduction in spleen parasite load. This protection was associated with a suppression of both interleukin (IL)-10 and IL-4 cytokines by spleen cells in response to L. chagasiantigen. No change was detected in the production of IFN-γ. Our data show that these immunogenic preparations reduce the type 2 immune response leading to the control of parasite replication.

Evaluación de la actividad citotóxica y leishmanicida de extractos y fracciones de Piper cumanense y Piper holtonii / Evaluation of the cytotoxic and leishmanicidal activity of extracts and fractions of Piper cumanense and Piper holtonii

Especies del género Piper son reportadas como promisorias para el tratamiento de enfermedades tropicales. Este estudio evalúa la actividad citotóxica y leishmanicida de extractos y fracciones de diferente polaridad obtenidas de las especies vegetales Piper cumanense (P. cumanense) y Piper holtonii (P. holtonii); se emplearon macrófagos murinos J774 y promastigotes de Leishmania panamensis MHOM/CO/87/UA140. La fracción hexánica (PcH) presentó un efecto leishmanicida con una selectividad de 2 en los modelos in vitro empleados. Esta selectividad permite sugerir una potencial actividad antileishmanial, que amerita seguir siendo explorada.

Piper genus’ species are reported as promissory as tropical diseases treatment. This research showed the cytotoxic and leishmanicidal activity of extracts and fractions of different polarity derived from Piper cumanense (P. cumanense) and Piper holtonii (P. holtoni) on murine macrophages J774 and L. panamensis promastigotes (MHOM/ CO/87/UA140). Hexanic fraction (PcH) exhibited leishmanicidal effect with 2-fold index selectivity in this in vitro model used. These results suggest a potential antileishmanial activity which should be more studied.

Subcutaneous immunization against Leishmania major - infection in mice: efficacy of formalin-killed promastigotes combined with adjuvants / Imunização subcutânea na infecção do camundongo pela Leishmania major: eficácia dos promastigotos mortos pela formalina combinada com adjuvantes

Formalin-killed promastigotes (FKP) of Leishmania major, in combination with Montanide ISA 720 (MISA), BCG or alum were used in vaccination of an inbred murine model against cutaneous leishmaniasis (CL). Significant and specific increases in anti-FKP IgG responses were detected for both alum-FKP and BCG-FKP compared to MISA-FKP (p < 0.001). Significant increases in splenic lymphocyte recall proliferation was obtained in the MISA-FKP vaccinated mice compared to alum-FKP or BCG-FKP vaccinated groups (p < 0.01). The highest interferon-ã responses were observed in the BCG-FKP group followed by the MISA-FKP while the alum-FKP gave the least responses. Significantly reduced lesion sizes were obtained in the MISA-FKP group compared to the BCG/alum adjuvants-FKP vaccinated groups. Although the BCG-FKP group showed the highest IFN-ã responses, it failed to control cutaneous lesions. Significant reductions in parasite numbers were observed in the MISA-FKP and BCG-FKP vaccinated groups (p < 0.001). There was a good correlation between parasite burden and IFN-ã level indicating IFN-ã response as a sensitive parameter of the immune status. In conclusion, MISA-FKP is the most efficacious vaccine formulation against murine cutaneous leishmaniasis.

Promastigotos mortos pela formalina (FKP) de Leishmania major combinados com Montanide ISA 720 (MISA), BCG ou alumen foram usados na vacinação de modelo murino cutâneo de leishmaniose (CL). Aumento significante e específico de resposta IgG anti FKP foram detectados tanto no FKP com alumen como naquele com BCG comparados ao MISA-FKP (p < 0,001). Aumento significante da proliferação esplênica de linfócitos de memória foi obtida nos camundongos vacinados com MISA-FKP quando comparados aos grupos vacinados com alumen-FKP ou BCG-FKP (p < 0,01). As maiores respostas por interferon-gama foram observadas no grupo BCG-FKP seguido pelo MISA-FKP enquanto que o alumen-FKP deu a menor resposta. No grupo MISA-FKP foram obtidas reduções significantes do tamanho das lesões quando comparado aos grupos vacinados com BCG/adjuvante de alumen-FKP. Embora o grupo BCG-FKP tenha mostrado a maior resposta por interferon-gama, não houve controle das lesões cutâneas. Redução significante no número de parasitas foi observada tanto no grupo vacinado com MISA-FKP como no BCG-FKP (p < 0,001). Houve boa correlação entre a carga parasitária e o nível de interferon-gama indicando que a resposta do interferon-gama é parâmetro sensível do estado imunológico. Em conclusão, MISA-FKP é a forma mais eficaz de vacina contra a leishmaniose cutânea murina.

Comparative evaluation of phenol and thimerosal as preservatives for a candidate vaccine against American cutaneous leishmaniasis

For decades thimerosal has been used as a preservative in the candidate vaccine for cutaneous leishmaniasis, which was developed by Mayrink et al. The use of thimerosal in humans has been banned due to its mercury content. This study addresses the standardization of phenol as a new candidate vaccine preservative. We have found that the proteolytic activity was abolished when the test was conducted using the candidate vaccine added to merthiolate (MtVac) as well as to phenol (PhVac). The Montenegro's skin test conversion rates induced by MtVac and by PhVac was 68.06 percent and 85.9 percent, respectively, and these values were statistically significant (p < 0.05). The proliferative response of peripheral mononuclear blood cells shows that the stimulation index of mice immunized with both candidate vaccines was higher than the one in control animals (p < 0.05). The ability of the candidate vaccines to induce protection in C57BL/10 mice against a challenge with infective Leishmania amazonensis promastigotes was tested and the mice immunized with PhVac developed smaller lesions than the mice immunized with MtVac. Electrophoresis of phenol-preserved antigen revealed a number of proteins, which were better preserved in PhVac. These results do in fact encourage the use of phenol for preserving the immunogenic and biochemical properties of the candidate vaccine for cutaneous leishmaniasis.

Transmission blocking vaccines to control insect-borne diseases: a review

Insect-borne diseases are responsible for severe mortality and morbidity worldwide. As control of insect vector populations relies primarily on the use of insecticides, the emergence of insecticide resistance as well to unintended consequences of insecticide use pose significant challenges to their continued application. Novel approaches to reduce pathogen transmission by disease vectors are been attempted, including transmission-blocking vaccines (TBVs) thought to be a feasible strategy to reduce pathogen burden in endemic areas. TBVs aim at preventing the transmission of pathogens from infected to uninfected vertebrate host by targeting molecule(s) expressed on the surface of pathogens during their developmental phase within the insect vector or by targeting molecules expressed by the vectors. For pathogen-based molecules, the majority of the TBV candidates selected as well as most of the data available regarding the effectiveness of this approach come from studies using malaria parasites. However, TBV candidates also have been identified from midgut tissues of mosquitoes and sand flies. In spite of the successes achieved in the potential application of TBVs against insect-borne diseases, many significant barriers remain. In this review, many of the TBV strategies against insect-borne pathogens and their respective ramification with regards to the immune response of the vertebrate host are discussed.