Efeitos do fragmento variável de cadeia única anti-LDL eletronegativa vetorizado em nanocápsulas na aterosclerose experimental / Effects of an anti-LDL(-) single chain fragment variable vectorized in nanocapsules in experimental atherosclerosis

RESUMO

As doenças cardiovasculares são a principal causa de mortalidade no mundo. A aterosclerose é a base fisiopatológica dessas doenças, sendo definida como um processo crônico-inflamatório multifatorial, resultando da interação de diferentes células como linfócitos, macrófagos, células endoteliais e células musculares lisas na parede arterial. A lipoproteína de baixa densidade eletronegativa [LDL(-)], uma subfração modificada da LDL nativa, desempenha um papel-chave na aterosclerose, uma vez que as modificações sofridas por esta partícula são capazes de induzir o acúmulo de ésteres de colesterol em macrófagos e a subsequente formação de células espumosas. O sistema imunológico é crucial no processo aterogênico e estratégias terapêuticas direcionadas à imunoregulação deste processo têm sido utilizadas como novas alternativas tanto na prevenção do desenvolvimento quanto da progressão desta doença. Dentre essas estratégias, destaca-se o uso de fragmentos de anticorpos como o scFv (do inglês, single chain fragment variable), que podem ainda estar conjugados a nanopartículas com o intuito de aumentar sua eficiência de ação no organismo. Diante do papel da LDL(-) na aterosclerose, este projeto objetivou avaliar os efeitos in vitro e in vivo de um sistema nanoestruturado contendo fragmentos scFv anti-LDL(-) derivatizados na superfície de nanocápsulas sobre macrófagos murinos e humanos primários e em camundongos knockout para o gene do receptor da LDL (Ldlr-/-) no desenvolvimento e na progressão dessa doença. Demonstrou-se que o tratamento de macrófagos com a formulação scFv anti-LDL(-)-MCMN-Zn diminuiu de forma significativa a captação de LDL(-), assim como a expressão de IL-1ß (mRNA e proteína) e MCP-1 (mRNA). Foi demonstrada a internalização da nanoformulação pelos macrófagos via diferentes mecanismos de endocitose, demonstrando seu potencial uso como carreador de fármacos. In vivo, a nanoformulação diminuiu de forma significativa a área da lesão aterosclerótica em camundongos Ldlr-/- submetidos à avaliação pela técnica de tomografia por emissão de pósitrons (do inglês, PET), utilizando o radiotraçador 18F-FDG (18F-desoxiglicose), associada à tomografia computadorizada (CT) com agente de contraste iodado, além da análise morfométrica das lesões no arco aórtico. O conjunto dos resultados obtidos evidenciou a ação ateroprotetora da formulação scFv anti-LDL(-)-MCMN-Zn, reforçando seu potencial como estratégia terapêutica na aterosclerose

ABSTRACT

Cardiovascular diseases are the leading cause of mortality worldwide. Atherosclerosis is the pathophysiological basis of these diseases, defined as a chronic inflammatory multifactorial process, resulting from the interaction of several cells such as lymphocytes macrophages, endothelial cells and smooth muscle cells within the arterial wall. The electronegative low-density lipoprotein [LDL(-)], a modified subfraction of native LDL, plays a key role in atherosclerosis, since its modifications are capable of inducing the accumulation of cholesteryl esters in macrophages and the subsequent foam cells formation. The immune system is crucial in atherogenic process and therapeutic strategies directed to the immunoregulation of this process have been used as a new alternative in the prevention of the development as well as the progression of this disease. Among these strategies, it is the use of antibody fragments such as scFv (single chain fragment variable), which may be also conjugated to nanoparticles in order to increase their efficiency in the body. Given the role of LDL(-) in atherosclerosis, the aim of this project was to evaluate the in vitro and in vivo effects of a nanostructured system containing scFv anti-LDL(-) fragments derivatized on the surface of nanocapsules on murine and human primary macrophages and in the development and progression of the disease in LDL receptor knockout mice (Ldlr-/-). It was demonstrated that the treatment of macrophages with scFv anti-LDL(-)-MCMN-Zn formulation significantly decreases the uptake of LDL(-) and the expression IL-1ß (mRNA and protein) and MCP-1 (mRNA). Moreover, the internalization of the nanoformulation by macrophages through different endocytosis mechanisms was shown, demonstrating its potential use as a nanocarrier. In vivo, the nanoformulation decreased the area of atherosclerotic lesions in Ldlr-/- mice evaluated by positron emission tomography with 18F-FDG associated with computed tomography with iodinated contrast agent (PET/CT), besides the lesion morphometric analysis at the aortic arch Thus, these data provide evidence of the atheroprotection action of the ateroprotection action of the scFv anti-LDL(-)-MCMN-Zn formulation, suggesting its promising use as a therapeutic strategy for atherosclerosis