Edição genômica como estudo da regulação da expressão do hormônio de crescimento na síndrome de Prader-Willi / Genomic editing as a study of the regulation of growth hormone expression in Prader-Willi syndrome

RESUMO

A síndrome de Prader-Willi (SPW) é associada a distúrbios neurológicos, comportamentais e diversas deficiências hormonais, incluindo o hormônio do crescimento (GH). Embora o tratamento de reposição do GH melhore a composição corporal, o crescimento e o quadro clínico geral, esta não é uma cura e suas bases clínicas ainda são desconhecidas na síndrome. A SPW ocorre por três mecanismos moleculares deleção paterna da região 15q11-q13; dissomia uniparental materna 15; ou defeitos de imprinting. A linhagem celular GH3 de pituitária de rato foi utilizada por ser um modelo bem estudado de células secretoras de GH e prolactina. Utilizando o sistema CRISPR-Cas9, realizamos a deleção completa da região ortóloga da SPW de 3,2 Mb na linhagem GH3, produzindo o genótipo da síndrome in vitro, para investigar quais segmentos gênicos da SPW estão envolvidos na regulação do GH. A investigação de off-targets por sequenciamento Sanger revelou desde reparos sem alteração nucleotídica até grandes rearranjos nos flancos dos sítios-alvo dos gRNAs, inclusive com inserções não previstas de DNA exógeno. Nossos dados ressaltam a necessidade de projetar cuidadosamente as condições experimentais e caracterizar minuciosamente os materiais genéticos obtidos pelo sistema CRISPR-Cas9. A análise do DNA no flanco proximal da região da SPW em ratos demonstrou sequências que podem representar o marco inicial do silenciamento gênico por imprinting na região, assim como ocorre próximo a UBE3A em humanos na porção distal da região ortóloga. Os quatro modelos de sublinhagens SPW-Knockout gerados neste trabalho com deleções de 3,2 Mb envolvendo toda a região da SPW permitirão compreender melhor a relação entre os genes da síndrome e as vias moleculares envolvidas na regulação do GH, além da sua utilização como modelos em novos estudos sobre a SPW. O gene SNORD107 surgiu como o principal candidato a regular o GH dentro da região da SPW, podendo formar um complexo ribonucleoprotéico que exerceria função regulatória pós-transcricional na cadeia de produção do GH.

ABSTRACT

Prader-Willi syndrome (PWS) is associated with neurodevelopmental and behavioral abnormalities and numerous hormonal deficiencies, including growth hormone (GH). Although GH replacement treatment improves body composition, growth, and the overall clinical presentation, it is not a cure and its clinical basis is still unknown in the syndrome. PWS occurs by three molecular mechanisms paternal deletion of the 15q11-q13 region; maternal uniparental disomy 15; or imprinting defects. The rat pituitary GH3 cell line is a well-studied model of GH and prolactin-secreting cells. Using the CRISPR-Cas9 system, we performed the complete deletion of the 3.2 Mb PWS orthologous region in GH3 cells, generating the syndrome genotype in vitro to investigate which PWS genes are involved in GH regulation. Off-target analysis by Sanger sequencing revealed perfect breakpoint repairs, but also large rearrangements on the flanking sites of the gRNA targets, including unexpected insertions of exogenous DNA. These data highlight the need to carefully design the experimental conditions and fully characterize the genetic materials obtained by CRISPR-Cas9. DNA analysis on the proximal flank of the PWS region in rats has shown sequences that can mark the initial borders of genomic imprinting, as it occurs close to UBE3A in humans in the distal portion of the orthologous region. The four PWS-Knockout models generated in this work with 3.2 Mb deletions involving the entire PWS region will allow a better understanding of the relationship between PWS genes and the molecular pathways involved in GH regulation and can be used as models in new PWS studies. The SNORD107 gene has emerged as the main candidate to regulate GH within the PWS region and may form a ribonucleoprotein complex with a post-transcriptional regulatory function in the GH production pathway.