Electroforesis horizontal en geles de poliacrilamida en la detección y tipificación del virus de papiloma humano / Horizontal electrophoresis in polyacrylamide gels in the detection and typing of human papillomavirus

OBJETIVO: estandarizar el uso de electroforesis horizontal en poliacrilamida como un método rápido de fácil implementación y de alta sensibilidad para la detección y tipificación del virus del papiloma humano por reacción en cadena de la polimerasa-polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción con la enzima HpyCH4V como única enzima de restricción. MÉTODOS: Se utilizó el ácido desoxirribonucleico de 17 tipos de virus del papiloma humano, clonados en la colección del Laboratorio de Biología y Medicina Experimental (LABIOMEX-ULA), para la amplificación de la región flanqueada por los oligonucleótidos MY09/ MY11, los amplificados obtenidos se sometieron a digestión enzimática con la enzima HpyCH4V. El producto se corrió en geles de poliacrilamida de rápida polimerización en equipos de electroforesis horizontales. El ácido desoxirribonucleico se tiñó con bromuro de etidio y fueron fotografiados con la utilización de un trans-iluminador de luz ultravioleta. RESULTADOS: Se corrieron muestras de 17 tipos diferentes de virus del papiloma humano en geles de poliacrilamida en electroforesis horizontal sudmarina. Se observaron patrones de digestión, con la enzima de restricción HpyCH4V, bien definidos y distintos para 15 tipos diferentes. Se presentó una coincidencia de patrón polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción para los tipos 45 y 52 ambos de alto riesgo. Se obtuvo una excelente resolución en corridas de 2,5 cm de longitud para cualquier patrón polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción de los 17 tipos de virus del papiloma humano analizados. CONCLUSIÓN: El análisis de las corridas permitió una eficiente caracterización de los 17 tipos virales. La comparación del índice de movilidad relativa con polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción virtual de los fragmentos amplificados presentó diferencias mínimas, el análisis de la movilidad en agarosa y poliacrilamida se ajustaron perfectamente permitiendo la sustitución de la agarosa por la poliacrilamida.

OBJECTIVE: to standardize the use of horizontal electrophoresis in polyacrylamide as a quick method of easy implementation and high sensitivity for the detection and typing of Human Papillomavirus by PCR-FRLP with HpyCH4V enzyme as unique restriction enzyme. METHODS: DNA from 17 Human Papillomavirus types, cloned in the collection of the Laboratory of Experimental Biology and Medicine, for amplification of the region flanked by the MY09/ MY11 oligonucleotides were used, the amplified obtained were subjected to enzymatic digestion with the enzyme HpyCH4V. The product was run on polyacrylamide gels rapid polymerization horizontal electrophoresis equipment. Stained with ethidium bromide and were photographed with the use of a trans-illuminating UV. RESULTS: Samples of 17 different Human Papillomavirus types polyacrylamide gel electrophoresis were run horizontally. Digestion patterns were observed with the restriction enzyme HpyCH4V, well-defined and different for different types 15. A pattern match for RFLP types 45 and 52 both high risk presented. Excellent resolution on runs of 2.5 cm in length for any RFLP pattern of the 17 Human Papillomavirus types analyzed was obtained. CONCLUSION: The analysis of the runs allows efficient characterization of the 17 Human Papillomavirus types. Comparing the relative mobility rate with the virtual RFLP of amplified fragments present minimal differences, analyzing mobility in agarose and polyacrylamide perfectly adjusted allowing for substitution of agarose by polyacrylamide.

Estudio de variantes intra-tipo del virus del papiloma humano tipo16, por análisis nucleotídico de la región MY09-MY11 / Study of intra-type variants of papillomavirus human tipo16, by analysis of the nucleotide region MY09-MY11

OBJETIVO: Identificar variantes intratipo de VPH16 mediante el análisis de la región MY09/ MY11 del gen L1, en el Laboratorio de Biología y Medicina Experimental Labiomex, Universidad de Los Andes. Mérida. MÉTODOS: Estudio descriptivo de corte transversal donde se procesaron 45 muestras del área genital, 38 femeninas y 7 masculinas, que presentaron infección por VPH16. Se realizó un análisis polimórfico de cadena sencilla del ADN (SSCP) con la finalidad de descubrir diferencias polimórficas de intratipo, se analizaron los diferentes polimorfismos hallados por secuenciación automática, y se establecieron las relaciones filogenéticas y funcionales de las variantes encontradas. RESULTADOS: Se logró detectar tres variantes intratipo de VPH16 de la región MY09/ MY11 del gen L1. Las variantes corresponden a sustituciones nucleotídicas sinónimas. Se determinó que las 3 variantes detectadas de VPH16 pertenecen a la clase europea. CONCLUSIONES: El análisis polimórfico de la región L1 permitió determinar la presencia de variabilidad intratipo en el gen L1 de VPH16. Todas las variaciones fueron de tipo mutación puntual, no se detectaron inserciones ni deleciones. Se logró identificar la secuencia del clon referencial VPH16, lo cual resulta importante para el desarrollo de sistemas de diagnóstico, tipificación y vacunas.

OBJECTIVE: Identify variants of HPV-16 intratiping by analyzing the region MY09 / MY11 L1 gene, en el Laboratory of Experimental Biology and Medicine LABIOMEX, Universidad de Los Andes. Merida. METHODS: Cross sectional study in which 45 samples were processed in the genital area, 38 female and 7 male, with infection by HPV16. Polymorphic analysis was performed on single stranded DNA (SSCP) in order to discover intratipo polymorphic differences were analyzed different polymorphisms found by automatic sequencing and phylogenetic relationships were established and functional variants found. RESULTS: Intratipo able to detect three variants of HPV16 in the study population in the region MY09 / MY11 L1 gene. Variants correspond to nucleotide substitutions synonymous. It was determined that 3 of HPV16 variants detected belong to the European class. CONCLUSION: The analysis of the polymorphic region MY09/ MY11 allowed determining the presence of intratipe variability in the HPV16 L1 gene. All variations were kind of mutation, there were no insertions or deletions. We identified the sequences of HPV-16 reference clone, which is important for the development of diagnostic systems, characterization and vaccines.

Diseño de un sistema de PCR para la detección del virus del papiloma humano mediante el uso de oligonucleótidos degenerados de la región E6 / Desing of PCR system for detection of human papilloma virus by using degenerate oligonucleotides of the E6 region

Diseñar y estandarizar un sistema de PCR para detectar un amplio espectro de tipos de VPH en una sola reacción utilizando como blanco la región E6 del genoma viral. Utilizando secuencias del gen E6 de distintos tipos de VPH del NCBI y las herramientas informáticas Mult Alin versión 5.4.1. y Oligo Analyzer 1.1.2 se diseñaron oligonucleótidos degenerados que permitían la amplificación de un fragmento de aproximadamente 214 pb. Las muestras seleccionadas incluyen: 25 muestras de ADN, cada una positiva para un solo tipo de VPH tipificados por el sistema PCR-RFLP MY11/MY09 del gen L1. Se obtuvieron amplificados de aproximadamente 214 pb de 25 tipos distintos de VPH, se detectaron amplificados de E6 en muestras negativas para el sistema MY09/MY11. Se pudo determinar que el diseño de los oligonucleótidos degenerados fue altamente eficiente para la amplificación de por lo menos 25 tipos distintos de VPH lo que facilitaría la detección en muestras clínicas

Design and standardize a PCR system to detect a broad spectrum of HPV types in a single reaction using target the E6 region of the viral genome. Using E6 gene sequences of different HPV types and NCBI tools Mult Alin Oligo Analyzer version 1.1.2 5.4.1. Degenerate oligonucleotides were designed that allowed amplification of a fragment of approximately 214 bp. Selected samples include: 25 DNA samples, each positive for a single HPV type typified by PCR-RFLP system MY11/MY09 L1 gene. We obtained approximately 214 bp amplified from 25 different HPV types were detected in samples amplified from E6 negative MY09/MY11 system. It was determined that the design of degenerate oligonucleotides was highly efficient for amplification of at least 25 different HPV types which would facilitate detection in clinical samples

Infección por virus papiloma humano en pacientes con células escamosas atípicas de un programa de pesquisa de cáncer cervical / Human papilloma virus infection in patients with atypical squamous cells of a screening program for cervical cancer

Evaluar la frecuencia de la infección por virus del papiloma humano en pacientes con células escamosas atípicas de un programa de pesquisa de cáncer de cuello uterino. Laboratorio Asistencial “Lic. Celina Sánchez Rincón y Laboratorio de Biología y Medicina Experimental LABIOMEX. Universidad de Los Andes. Mérida, Estado Mérida. Estudio prospectivo y descriptivo que incluyó las pacientes vistas entre marzo de 2006 y diciembre de 2009. Se tomaron muestras para evaluación citológica y detección del virus papiloma humano, mediante la metodología molecular PCR-RFLP a pacientes de pesquisa de cáncer cervical. Se estudiaron 2 805 pacientes seleccionándose las que presentaron informe citológico de células escamosas con atipias de significado indeterminado y con atipias que no excluyen lesión intraepitelial escamosa de alto grado. Del total de mujeres evaluadas por citología, 121 (4,31 por ciento) tenían informe de anormalidades en células epiteliales. Las células escamosas atípicas se encontraron en 58 (2,06 por ciento) citologías, 52 (1,85 por ciento) eran células escamosas con atipias de significado indeterminado y 6 (0,21 por ciento) eran células escamosas con atipias que no excluyen lesión intraepitelial de alto grado. La prevalencia general de la infección por virus del papiloma humano fue de 32/58 (53,4 por ciento). Los virus del papiloma humano de alto riesgo oncogénico se encontraron en 10/58 (17,2 por ciento) de los casos, la mayoría en el grupo etario de 21-30 años. No se pudo determinar el tipo viral en un 16/58(27,5 por ciento) de las muestras. Se observó una elevada prevalencia de virus del papiloma humano en pacientes con informe citológico de células escamosas atípicas.

To evaluate the frequency of human papillomavirus infection in patients with atypical squamous cells of a cervical cancer detection program. Between March 2006 to December 2009, specimens for cervical smears and human papillomavirus molecular detection by PCR-RFLP were taken from the patients attended at the cervical cancer clinic prevention. Facultad de Farmacia y Bioanálisis. Laboratorio Asistencial “Lic. Celina Sánchez Rincón y Facultad de Ciencias, Laboratorio de Biología y Medicina Experimental LABIOMEX. Universidad de Los Andes. Mérida, Estado Mérida, Venezuela. A total of 2 805 patients were evaluated, those with atypical squamous cells of undetermined significance and atypical squamous cells that cannot exclude a high intraepithelial lesion were chosen. Abnormalities in epithelial cells were found in 4,31 percent. Atypical squamous cells were found in 58 (2,06 percent) of the cases, 1,85 percent were atypical squamous cells of undetermined significance and 0,21 percent were atypical squamous cells that cannot exclude a high intraepithelial lesion. The overall prevalence of human papillomavirus infection was 32/58 (53,4 percent). High risk human papillomavirus was found in 10/58 (17,2 percent)of the patients, most of them between 21 and 30 years old. Human papillomavirus could not be determinedin 16/58 (27,5 percent) of the cases. It was observed a high frequency of human papillomavirus in patients with atypical squamous cells in their cervical smears.

Distribución del polimorfismo del codón 72 del gen p53 en lesiones de cuello uterino / Distribution of codon 72 polymorphism of p53 gene in cervical lesions

Determinar la distribución del polimorfismo del codón 72 del gen p53 en pacientes que presentan lesiones cervicales asociadas a infección por VPH. Estudio descriptivo de corte transversal donde se procesaron 118 muestras del área genital femenina, de 59 mujeres sanas (controles) y 59 con lesiones cervicales NICI-NICII-NICIII y Ca in situ (casos), para la extracción y purificación del ADN. Se amplificó el exón 4 del gen p53, para la genotipificación del codón 72 mediante la técnica PCR-SSCP. Facultad de Ciencias, Laboratorio de Biología y Medicina Experimental LABIOMEX, Universidad de Los Andes. Mérida, Estado Mérida, Venezuela. La PCR-SSCP permitió determinar la frecuencia de los genotipos homocigotos arginina (Arg/Arg), prolina (Pro/Pro) y heterocigoto prolina/arginina (Pro/Arg). Para los casos el genotipo Arg/Arg tuvo una frecuencia de 32,20 por ciento y para los controles de 50,85 por ciento. El genotipo Pro/Pro se encontró en 5,09 por ciento de los casos y 11,86 por ciento para los controles. El genotipo Pro/Arg tuvo una distribución de 62,71 por ciento para los casos y 37,29 por ciento para los controles. En este estudio no se encontró una relación estadísticamente significativa entre la presencia del genotipo Arg/Arg y el desarrollo de lesiones cervicales

To determine the distribution of the polymorphism of the codon 72 of the gene p53 in patients that present cervical lesions associated to infection by VPH. Descriptive and transversal study through assessment of 118 samples of the genital feminine area were processed, of 59 healthy (control) women and 59 with cervical lesions NICI-NICII-NICIII and Ca in situ (cases), for the extraction and purification of the DNA. The exon 4 of the gene p53 was amplified, for the genotipification of the codon 72 by means of technical PCR-SSCP. Facultad de Ciencias, Laboratorio de Biologia y Medicina Experimental LABIOMEX, Universidad de Los Andes. Merida, Estado Merida, Venezuela. PCR-SSCP allowed determining the frequency of the homozygotes genotypes arginine (Arg/Arg), proline (Pro/Pro) and heterozygotes proline /arginine (Pro/Arg). For the cases the genotype Arg / Arg had a frequency of 32.20 percent and for the controls of 50.85 percent. The genotype Pro/Pro was in 5.09 percent of the cases and 11.86 percent for the controls. The genotype Pro/Arg had a distribution of 62.71 percent for the cases and 37.29 percent for the controls. In this investigation there was not a statistically significant relationship among the presence of the genotype Arg/Arg and the development of cervical lesions

Detección y tipificación de virus del papiloma humano (VPH) mediante PCR-RFLP / Detection and typication of human papilloma virus (VPH) via PCR-RFLP

Estandarizar una técnica de PCR-RFLP para la detección y tipificación de VPH en mujeres con diagnóstico clínico previo de infección por VPH. Estudio descriptivo de corte transversal donde se procesaron 189 muestras del área genital de mujeres que acudieron para extracción de ADN, diagnóstico y tipificación por técnicas moleculares: PCR-RFLP. El ambiente fue en la Facultad de Ciencias, Laboratorio de Biología y Medicina Expiremental LABIOMEX, Universidad de Los Andes, Mérida, Estado Mérida, Venezuela. La PCR-RFLP permitió detectar el virus y su identificación. El 16.8 por ciento de las muestras presentó VPH de alto riesgo tipos 16, 31, 33, 35, 56, 59 y 68; y el 6.8 por ciento presentó VPH de riesgo intermedio tipos 51, 53, 58, 61 y 83; y el 18 por ciento los tipos de bajo riesgo 6, 32, 53, 54 y 81. La técnica PCR-RFLP estandarizada fue adecuada para el diagnóstico y la tipificación de VPH en muestras del área genital. El 51.9 por ciento del total de las muestras resultaron positivas para VPH, siendo VPH 16 el subtipo de alto riesgo más común (20.0 por ciento), y VPH 6 el de bajo riesgo más frecuente (23.8 por ciento).