Expression and characterization of scFv-6009FV in Pichia pastoris with improved ability to neutralize the neurotoxin Cn2 from Centruroides noxius.

Small single-chain variable fragments (scFv) are promising biomolecules to inhibit and neutralize toxins and to act as antivenoms. In this work, we aimed to produce a functional scFv-6009FV in the yeast Pichia pastoris, which inhibits the pure Cn2 neurotoxin and the whole venom of Centruroides noxius. We were able to achieve yields of up to 31.6 ± 2 mg/L in flasks. Furthermore, the protein showed a structure of 6.1 % α-helix, 49.1 % ß-sheet, and 44.8 % of random coil by CD. Mass spectrometry confirmed the amino acid sequence and showed no glycosylation profile for this molecule. Purified scFv-6009FV allowed us to develop anti-scFvs in rabbits, which were then used in affinity columns to purify other scFvs. Determination of its half-maximal inhibitory concentration value (IC50) was 40 % better than the scFvs produced by E. coli as a control. Finally, we found that scFv-6009FV was able to inhibit ex vivo the pure Cn2 toxin and the whole venom from C. noxius in murine rescue experiments. These results demonstrated that under the conditions assayed here, P. pastoris is suited to produce scFv-6009FV that, compared to scFvs produced by E. coli, maintains the characteristics of an antibody and neutralizes the Cn2 toxin more effectively.

IgY pharmacokinetics in rabbits: implications for IgY use as antivenoms.

This paper presents the first study of chicken IgY pharmacokinetics (PK) in rabbits. We measured IgY blood serum concentrations using a specific high sensitivity ELISA method. The fast initial component observed when studying horse Fab, F(ab')2 or IgG was absent from IgY PK. During the first 80 min of observation there was only a single slow exponential decay, which sped up afterward to the point that IgY became undetectable after 216 h of observation; due to this time course, PK parameters were determined with trapezoidal integration. The most significant IgY pharmacokinetic parameters determined were (all presented as medians and their 95% confidence interval): Area Under the Curve = 183.8 (135.2, 221.5) mg·h·L(-1); Distribution volume of the central compartment·[Body Weight (BW)](-1) = 46.0 (21.7, 70.3) mL·kg(-1); Distribution volume in steady state·BW(-1) = 56.8 (44.4, 68.5) mLkg(-1); Mean Residence Time = 40.1 (33.6, 48.5) h; Total plasma clearance·BW(-1) = 1.44 (1.15, 1.66) mL·h(-1)·kg(-1). Anti IgY IgG titers determined by ELISA increased steadily after 72 h, and reached 2560 (1920, 5760) dilution(-1) at 264 h; anti-chicken IgG concentrations rose up to 3.19 (2.31, 6.17) µg/mL in 264 h. Our results show that IgY PK lacks the fast initial decay observed in other PK studies using horse IgG, F(ab')2 or Fab, remains in the body 39.0 (28.7, 47.2) % much as IgG and is ≈3 times more immunogenic that horse IgG in rabbits.

Production of anti-horse antibodies induced by IgG, F(ab')2 and Fab applied repeatedly to rabbits. Effect on antivenom pharmacokinetics.

We separated whole IgG, Fab and F(ab')2 fragments from horse plasma. We previously studied the pharmacokinetics of these immunoglobulins and fragments in rabbits and shown that Fab and F(ab')2 pharmacokinetics were well described by a three-exponential kinetics, while IgG and IgG(T) pharmacokinetics, however, deviated from the three-exponential kinetics 120 h after injecting a bolus of the immunotherapeutics; this departure was shown to be due to a surge of anti-horse antibodies occurring after 120 h, peaking at ≈260 h and decaying slowly afterward (Vázquez et al., 2010). We now describe antivenom pharmacokinetics and anti-horse IgG production in rabbits receiving three boluses (300 µg/kg, I.V.) of Fab, F(ab')2 or IgG separated by 21 days.

High resolution fluorescence microscopy evidence on the transport of immunoglobulins. Differences between mammalian IgG, F(ab')2 and avian IgY.

We describe the subcellular localization of horse F(ab')(2) and IgG, and ostrich IgY labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) administered IV to mice. We used wide field high sensitivity fluorescence microscopy deblurred by 3-dimensional blind deconvolution of kidney, liver, lungs and brain sections. Sections were obtained from mice sacrificed 15 min, 1 or 5 h after receiving FITC-immunoproteins, counter-stained with DAPI (4',6'-diamidino-2-phenylindole) and Evans blue. FITC-IgG and its fractions are rapidly taken up and extravasated by vascular endothelium. FITC-IgG and FITC-F(ab')(2) appear to be quickly secreted by glomeruli endothelium and to be reabsorbed along all nephron segments. FITC-IgG and FITC-F(ab')(2) appeared 15 min after IV injection within bronchial, alveolar and bile duct epithelium. Hepatocytes were loaded with fluorescence after 15 min of administration. Fluorescence was absent from brain slices, except for the endothelium of some vessels in brain ventricles which appeared intensely fluorescent. Fluorescence appeared in intracellular vesicles which conferred the tissues a glowing foamy aspect for up to 5 h after inoculation. Arterial elastic layers were intensely green after horse FITC-Ig inoculation. Ostrich FITC-IgY behaved completely differently to horse Ig's; only 1 h after injection it was possible to observe small brightly green scarce vesicles in vascular endothelium of arteries, interstitial kidney capillaries between nephron tubules and were also scarce in glomeruli endothelium; FITC-IgY appeared only in hepatic sinusoids in the liver. No IgY was seen in bronchial and alveolar endothelium, in bile ducts or in hepatocytes.

Horse IgG- and ostrich IgY-F(ab')2 groups have different affinities for mice erythrocytes and lymphocytes. Implications for avian immunoglobulin therapeutic usefulness.

We used high sensitivity and resolution fluorescence microscopy to study the interaction of ostrich IgY, horse F(ab')2 and horse IgG with mice lymphocyte and erythrocyte plasma membrane. The immunoglobulins were labeled with fluorescein isotiocyanate (FITC). Our results show an interaction of IgY with lymphocyte plasma membrane which does not result in endocytosis of the labeled protein. Less IgG and its F(ab')2 fraction bind to lymphocytes, and this binding seems to be followed by endocytosis producing a diffuse cytoplasmic fluorescence in most lymphocytes exposed to FITC-IgG or FITC-F(ab')2. Cytoplasmic fluorescence resembling FITC was not observed in lymphocytes exposed to FITC-IgY. Receptors in the erythrocyte membrane also differentiate between avian and horse Ig; while erythrocytes exposed to horse Igs became intensely fluorescent for at least 5 h, no erythrocyte labeling occurred when FITC-IgY was used. Our results suggest that IgY may be a stronger activator of adaptive immunity than horse IgG in mammals. Adaptive immunity against IgY is detrimental to its IV therapeutic use in humans and other mammals.

Pharmacokinetics of a F(ab')2 scorpion antivenom administered intramuscularly in healthy human volunteers.

This paper presents the first study of F(ab')(2) scorpion antivenom pharmacokinetics in humans after intramuscular (im) administration. The specific anti-Centruroides scorpion antivenom was used in 6 human healthy volunteers. The fabotherapeutic was administered as a 47.5mg im bolus. Blood samples were drawn at 0, 5, 15, 30, 45, 60 , 90, 120, and 180 min, 6h and at 1, 2, 3, 4, 10 and 21 days after antivenom administration. We measured antivenom concentrations in serum using a specific high sensitivity ELISA method for F(ab')(2). Antivenom concentration in serum was fit to a 3 compartment model (inoculation site, plasma and extra vascular extracellular space), it was assumed that the venom may also be irreversibly removed from plasma. Calculated time course of antivenom content shows that at any time no more that 16.6 (5.3, 31.9)% (median and 95% confidence interval) of the antivenom bolus is present in plasma. The time to peak plasma [F(ab')(2)] was 45 (33, 74) h. The most significant antivenom pharmacokinetic parameters determined were: AUC(im,∞)=803 (605, 1463) mg·h·L(-1); V(c)=8.8 (2.8, 23.6) L; V(ss,im)=55 (47, 64) L; MRT(im)=776(326, 1335) h; CL(t)=3.7 (0.6, 1.9) mL·min(-1); f(im,)V(ss)=0.300 (0.153, 0.466). Comparing these parameters with the ones obtained intravenously by Vázquez et al., the parameters were more disperse between subjects, determined with more uncertainty in each individual subject, and the peak F(ab')(2) in plasma occurred with considerable delay; all indicating that the IM route should not be used to administer the antivenom, with the possible exception of cases occurring very far from hospitals, as an extreme means to provide some protection before the IV route becomes available.

Carcinoma hepatocelular. Presentación de dos casos interesantes / Two interesting cases of Hepatocellular Carcinoma

Se presentaron dos pacientes con el diagnóstico de Carcinoma hepatocelular ingresados en el servicio de Medicina Interna del Hospital Central De Maputo, Mozambique, los cuales se comportaron evolutivamente diferente a lo observado en Cuba. Encontramos en el examen físico de estos casos hepatomegalias de grandes dimensiones, anemia, ertrosedimentación elevada, de los marcadores hepáticos la fosfatasa alcalina también elevada y la negatividad del HBS Ag. El estudio Ecográfico y tomográfico además de la Biopsia Aspirativa hepática concluyó el diagnóstico de certeza. A pesar de lo avanzado de la enfermedad, los pacientes lograban cierta tolerancia con las manifestaciones clínicas que presentaban por la neoplasia.

Two patients suffering from hepatocellular carcinoma are presented. They were admitted at Internal Medicine Service at Maputo Central Hospital. Mozambique. They had a different evolutive behaviour in relation to what was observed in Cuba. At physical examination it was found large hepatomegalia, anaemia, high erithrosedimentation rate, hepatic markers, alkaline phosphates and non-positive HBS Ag. Diagnosis was confirmed by the echocardiography, tomography and hepatic aspiration biopsy. In spite of the progressive disease, patients presented some tolerance to clinical manifestations due to neoplasm.

North and South American Loxosceles spiders: development of a polyvalent antivenom with recombinant sphingomyelinases D as antigens.

We report the cloning of sphingomyelinase D (SMD) cDNA from Loxosceles reclusa, Loxosceles boneti and Loxosceles laeta into bacterial expression systems, as well as optimization of expression conditions so as to obtain soluble and active recombinant enzymes. The recombinant mature SMDs, tagged with a histidine tail at the N- or C-termini, were compared in terms of toxicity and enzymatic activity, and were used as immunogens for the production of monovalent antisera in rabbits and F(ab')(2) preparations in animals used for commercial antivenom production (horses). We performed studies on in vitro inhibition of enzymatic activity of natural venom preparations by antibodies generated against the tagged proteins. We also present and discuss the results of studies on the specific and para-specific in vivo protective potential of the rabbit and equine antibody preparations against the recombinant proteins themselves and natural venom preparations. Our conclusions support the feasibility of using recombinant SMDs for production and evaluation of polyvalent anti-Loxosceles antivenoms, and we offer data on the potential of paraspecific neutralization in the context of the antigenic groupings and the molecular phylogeny of those active SMDs for which amino acid sequence information is available.

Mujeres que viven con VIH/SIDA y servicios de salud. Recomendaciones para mejorar la calidad de la atención / Women that live with HIV/AIDS and health services. Recomendations for improve the quality of care

"Entre los aspectos que resultan cruciales para las mujeres con VIH (Virus de la Inmunodeficiencia Humana) se encuentran los servicios de salud, los recursos disponibles para hacer frente a la infección y el acceso real que tienen a los mismos. Conocer este ámbito de la realidad e identificar líneas orientadoras para su mejoramiento es el propósito de este estudio realizado con mujeres VIH positivas, del cual derivan múltiples recomendaciones para mejorar la calidad de la atención que se les ofrece." (AU). Contenido: 1) Introducción: objetivos de la investigación, metodología, población estudiada. 2) Marco de referencia para la respuesta al VIH/SIDA: consideraciones sobre el sector de mujeres. 3) Los servicios a través de la experiencia y las voces de las mujeres: : importancia de los servicios y barreras para el acceso; caracterización (servicios de prevención; prueba, conserjería y diagnóstico; consentimiento informado y conserjería pre y post prueba; pruebas de laboratorio); atención médica (calidad y calidez; barreras socio-culturales y socio-económicas para el acceso; servicios especializados; ginecología; apoyo psicológico); estigma y discriminación en servicios médicos; medicamentos y adherencia; embarazo y derechos sexuales y reproductivos; relación con los médicos y otros prestadores de servicios de salud. 4) Conclusiones y recomemdaciones: prevención; prestación de servicios de salud; personal de salud; investigación; usuarios de los servicios de salud y sus parejas; derechos humanos; consentimiento informado. Anexo: guía de entrevista sobre acceso a servicios

Frecuencia de enfermedad tiroidea autoinmune en niños con diabetes mellitus tipo 1 / Frequency of autoimmune thyroid disease in children with type 1 diabetes mellitus

Introducción. Los reportes en la literatura mundial informan una prevalencia de enfermedad tiroidea en pacientes con diabetes mellitus insulino-dependiente de 7.3 a 23.4 por ciento y se ha identificado como factor de riesgo de enfermedad tiroidea a los anticuerpos microsomales (ACM). Los objetivos de este estudio fueron determinar la frecuencia de enfermedad tiroidea en la población de pacientes diabéticos tipo 1 y la prevalencia de ACM en dichos pacientes.Material y métodos. Estudio observacional, transversal y descriptivo. Se estudiaron pacientes con diabetes mellitus tipo 1 que acudieron al Departamento de Endocrinología del Hospital Infantil de México Federico Gómez de febrero a septiembre de 1998. A todos los pacientes se les realizó palpación del cuello en búsqueda intencionada de bocio, perfil tiroideo y anticuerpos microsomales. Los resultados se evaluaron por medio de la prueba t de Student, chi cuadrada y los valores predictivos con análisis Bayesiano.Resultados. De los 108 pacientes, 41 correspondieron al género masculino y 67 al femenino. Se encontraron 13.9 por ciento de pacientes con bocio, 18.3 por ciento con disfunción tiroidea y 6.4 por ciento con ACM positivos. Predominó el bocio eutiroideo con 53.3 por ciento, seguido de bocio hipotiroideo en 33.3 por ciento. El hipotiroidismo se encontró posterior al inicio de la diabetes mellitus tipo 1 (2.76 ñ 0.9 años) y el hipertiroidismo fue prácticamente concomitante (0.42 ñ 0.5). Se encontró un valor predictivo positivo de 71 por ciento y un valor predictivo negativo de 86 por ciento para disfunción tiroidea con ACM, considerándose éstos como un factor de riesgo y no como un factor determinante.Conclusiones. Se encontró una frecuencia elevada de pacientes diabéticos tipo 1 con bocio y disfunción tiroidea. Se recomienda la realización de perfiles tiroideos anuales en estos pacientes.

Evaluación ultrasonográfica de las mediciones renales en el neonato de término / Ultrasound evaluation of renal measures in normal full term newborn infant

Objetivo. Presentar la distribución de los valores en la medición renal en recién nacidos a término, sin patología agregada, bajo la posible influencia de las variables de edad gestacional, peso al nacer y sexo. Material y métodos. Se incluyeron a recién nacidos a término, sin patología agregada; fueron resgistradas las variables de edad gestacional, sexo y peso al nacer, evaluadas en los primeros tres días de vida. Se realizó ultrasonido abdominal, empleando un transductor sectorial multifrecuencia de 7.5 MHz. Se efectuaron las mediciones longitudinal y anteroposterior, así como el cálculo de perímetro y el área de ambos riñones. Resultados. Se incluyeron 83 neonatos. No se observaron diferencias significativas en las mediciones ultrasonográficas entre ambos riñones, ni con respecto a las variables de sexo, edad gestacional o peso al nacer. Los valores promedios de toda la muestra, fueron de 4.1, 2.0, 10.3 cm y 6.8 cm2, para las mediciones longitudinal, diámetro anteroposterior, perímetro y área, respectivamente. Se reportaron los valores percetilares de cada medición. Conclusiones. No se documentó el efecto de las varibles de sexo, edad gestacional o peso al nacimiento sobre mediciones renales; estos resultados pueden ser útiles como referencia en la evaluación de la morfología y tamaño de la silueta renal en la población neonatal de recién nacidos de término

Cristalización de insulina: importancia del semillamiento en la calidad del producto final

Se compararon 2 procedimientos tradicionales de obtención de pequeños cristales de insulina para utilizarse como medio de semillamiento en procesos de cristalización, partiendo ambos de la liofilización de soluciones de insulina bovina altamente purificada. Experimentalmente se demostró que, para evitar el fenómeno de nucleación secundaria y, por ende, asegurar una buena uniformidad en el tamaño de cristales del producto final de insulina, se impone un semillamiento con cristales de alrededor de 2 m, obtenidos a partir de la liofilización de soluciones con la misma composición química del medio donde deben desarrollarse los cristales de semilla.

Cristalización de insulina: factores que influyen en la cinética de crecimiento

Se implementó un procedimiento de cristalización en soluciones de insulina porcina altamente purificada, basado en la inoculación de cristales de semilla con una distribución de tamaños conocida. Se comprobó que cualquier desbalance en la composición química del medio influye negativamente en la obtención de la esperada forma rombohédrica para el producto cristalino de insulina. Además, se demostró que la velocidad de crecimiento de los cristales en las primeras horas aumenta relativamente con la adición de surfactantes, aunque la mayor influencia está dada aún por la concentración de insulina en solución y el área superficial específica de los cristales.

Medición ultrasonográfica de ventrículos laterales e índice ventricular en recién nacidos de prétermino / Ultrasonographic measures of lateral ventricles and ventricular index on preterm newborns

Introducción. La ultrasonografía transfontanelar (UT) es el método de estudio cerebral más popular en la etapa neonatal; el objetivo del estudio fue describir los valores normales del tamaño ventricular de niños prematuros mexicanos. Material y métodos. Se estudiaron por UT en forma prospectiva 121 recién nacidos prematuros sin enfermedad cerebral. Resultados. La medición vertical fue en promedio de 2.16 mm, resultando menor en el grupo de 33 a 34.6 semanas (F = 13.9, P < 0.005); se encontró colapso ventricular en el 29 por ciento de los ventrículos medidos. El promedio de la medición transversal fue de 9.07 mm y el índice ventricular promedio fue de 0.31, sin existir diferencia entre los grupos de edad gestacional (F = 2.1 y 1.99, P = NS). Conclusiones. Los valores encontrados en la medición vertical son menores a lo descrito por otros autores; un tercio de los ventrículos evaluados mostraron colapso que interpretamos como una variante normal en ausencia de otros signos de patología cerebral

Medición ultrasonográfica de ventrículos laterales e índice ventricular en recién nacidos de término sanos / Ventricular measurements (horizontal, vertical diameters and ventricular index) by fontanelar in healthy term newborn

Se realizó estudio ultrasonográfico transfontanelar a 150 recién nacidos de término sano; se midieron los diámetros transversales, verticales y el índice ventricular. Se encontró en diámetros transversales y verticales valores menores a los reportados en otros países y en el 24 por ciento un colapso ventricular. Se concluye que los valores ventriculares para niños sanos mexicanos son menores a lo reportado y que el colapso ventricular es un hallazgo normal que debe interpretarse con reserva al estudiar niños enfermos. El índice ventricular permanece estable a pesar del colapso ventricualar y puede ayudar al diagnóstico de dilatación ventricular patológica

Enfermedad de Kawasaki en México: análisis de 13 casos / Kawasaki disease in Mexico: an analysis of 15 cases

Se analizaron los expedientes clínicos de 13 niños con enfermedad de Kawasaki internados en cuatro diferentes hospitales. La edad promedio fue de tres años (nueve meses a nueve años) predominando el sexo masculino 3.3:1. Se efectuó ecocardiograma en diez pacientes; siete mostraron aneurismas coronarios (70%). Otras complicaciones fueron: miocarditis en seis y artritis, pericarditis, insuficiencia cardiaca, trombosis coronaria, vesicula biliar hidrópica y meningitis aséptica en un caso respectivamente. Todos se recuperaron; sólo cuatro pacientes con aneurismas tuvieron seguimiento ecocardiográfico mostrando tres de ellos desaparición de éstos entre uno y cinco meses después y el restante, persistencia del aneurisma más miocardiopatía dilatada en un estudio efectuado 2.5 años después. Destaca la elevada ocurrencia de aneurismas (70%) comparadas con otras series (20-65%) tal vez, entre otras razones, por sospechar el diagnóstico sólo en los casos típicos

Diseño de una formulación yodo-povidona solución / Design of a formulation of povidone-iodine solution

Se trabajó en el diseño de una formulaciòn líquida de yodo-povidona, para uso tópico, con una concentración del 10% del yodóforo, de manera que suministrara alrededor del 1% del yodo disponible. Se estudiaron, además del comportamiento tecnológico en el tiempo, las propiedades tensoactivas de la solución, así como su caracterìsticas de flujo. Farmacològicamente se evaluaron su acción irritante y la actividad bactericida in vivo e in vitro de la misma. De esta forma se logró la obtención de un producto terminado cuya fórmula y técnica de preparación brindan una solución física, química y microbiológicamente estable y que ofrece una acción terapéutica efectiva comprobada, pudiendo ser reprocida a mayores volúmenes