Comprehensive analysis of RHD alleles in Argentineans with variant D phenotypes.

BACKGROUND: The serologic assignment of the RhD status may be hindered in patients with weak D expression. A comprehensive study of RHD alleles occurring in the mixed population of Argentina is necessary to evaluate the most suitable DNA typing strategy. STUDY DESIGN AND METHODS: A total of 18,379 patients from two stratified groups, Group 1 (G1; public hospital) and Group 2 (G2; private laboratory), were RhD phenotyped, and 88 samples with reduced D expression underwent molecular characterization. RESULTS: The frequencies of D+, D-, and variant D phenotypes differed significantly (p < 0.001) between G1 and G2 (94.49% vs. 87.66%, 5.15% vs. 11.58%, and 0.36% vs. 0.75%, respectively). Eleven alleles were responsible for the weak D expression. Approximately 60% of the variant D phenotypes from G1 and G2 were weak D Types 1 through 4.0/4.2 and 25% were DVII. RHD alleles associated with African ancestry were encountered in G1. A new -282G>A mutation within the promoter region of DAU-4 and DOL alleles was identified. Three weak D Type 1 samples on R(0) haplotypes were found in G1. CONCLUSIONS: The D phenotype distribution in G2 resembles that in Europeans while the frequencies in G1 account for the Amerindian and African genetic contribution. The genotyping strategy described here is suitable to study D variants in the overall population and could allow a better use of the few available D- units and a rational administration of anti-D immunoprophylaxis. The results also show that weak D Type 1 alleles do not exclusively segregate with a Ce allele, as assumed until present.

Distribution of the FYBES and RHCE*ce(733C>G) alleles in an Argentinean population: implications for transfusion medicine.

BACKGROUND: The understanding of the molecular bases of blood groups makes possible the identification of red cell antigens and antibodies using molecular approaches, especially when haemagglutination is of limited value. The practical application of DNA typing requires the analysis of the polymorphism and allele distribution of the blood group genes under study since genetic variability was observed among different ethnic groups. Urban populations of Argentina are assumed to have a white Caucasian European genetic component. However, historical and biological data account for the influence of other ethnic groups. In this work we analyse FY and RH blood group alleles attributed to Africans and that could have clinical implications in the immune destruction of erythrocytes. METHODS: We studied 103 white trios (father, mother and child, 309 samples) from the city of Rosario by allele specific PCRs and serological methods. The data obtained were analysed with the appropriate statistical test considering only fathers and mothers (n = 206). RESULTS: We found the presence of the FY*BES and RHCE*ce(733C>G) alleles and an elevated frequency (0.0583) for the Dce haplotype. The number of individuals with a concomitant occurrence of both alleles was significantly higher than that expected by chance. We found that 4.68% of the present gene pool is composed by alleles primarily associated with African ancestry and about 10% of the individuals carried at least one RH or FY allele that is predominantly observed among African populations. Thirteen percent of Fy(b-) subjects were FY*A/FY*BES. CONCLUSION: Taken together, the results suggest that admixture events between African slaves and European immigrants at the beginning of the 20th century made the physical characteristics of black Africans to be invisible nowadays. Considering that it was a recent historical event, the FY*BES and RHCE*ce(733C>G) alleles did not have time to become widespread but remain concentrated within families. These findings have considerable impact for typing and transfusion strategy in our population, increasing the pool of compatible units for Fy(b-) individuals requiring chronic transfusion. Possible difficulties in transfusion therapy and in genotyping could be anticipated and appropriately improved strategies devised, allowing a better management of the alloimmunization in the blood bank.

Use of the erythrophagocytosis assay for predicting the clinical consequences of immune blood cell destruction.

The erythrophagocytosis assay is a useful parameter to evaluate the immune erythrocyte destruction occurring in vivo. The aim of this work was to use this assay in: a) the diagnostic and therapeutic assessment of autoimmune haemolytic anaemia (AIHA), b) the selection of blood for immunized patients requiring transfusion and c) the prediction of the severity of haemolytic disease of the newborn (HDN). This assay was also used to study the physiological removal of senescent erythrocytes from the circulation. The erythrophagocytosis assay was carried out incubating different erythrocyte suspensions and peripheral blood monocytes. A total of 200 monocytes were analysed to determine the percentage of active monocytes (% AM). We have demonstrated the usefulness of the erythrophagocytosis assay in the diagnosis of AIHA, mainly in patients with a negative direct antiglobulin test. This assay is also more adequate than classic immunohaematologic tests to obtain a better evaluation of the patients' response to treatment. The erythrophagocytosis assay was performed in immunized patients requiring transfusion and allowed us to select the least incompatible units. This method showed a better correlation with the newborns' clinical outcome than serological tests in cases of HDN. This functional assay also indicated an increased rate of erythrophagocytosis of senescent erythrocytes compared with young erythrocytes.

Clinical aspects of Rh genotyping.

The Rh antigens are encoded by the RHD and RHCE genes. In RhD negative individuals the RHD gene is absent or grossly deleted. Routinely, Rh typing is performed by haemagglutination. However, there are some clinical situations in which serological techniques are not suitable for determining the red blood cell phenotype accurately. Most anti-D sera may not agglutinate erythrocytes possessing a reduced expression of the D antigen. In these cases, DNA-based analyses may be better than serological typing to infer the appropriate phenotype. Agglutination methods are also of limited use for determining the red blood cell phenotype of a foetus at risk of haemolytic disease of the newborn. Molecular RHD typing using amniocytes or DNA obtained from maternal plasma may obviate the need of amniocenteses during pregnancy when the foetus is RhD negative, thus providing an important tool in managing possible sensitization by foetal erythrocytes. Classical haemagglutination has limitation in patients with autoimmune haemolytic anaemia. Erythrocytes coated with IgG cannot be accurately typed for red blood cell antigens, particularly when directly agglutinating antibodies are not available or IgG removal by chemical treatment is insufficient. Molecular genotyping is very important for determination of the true blood group antigens of these patients. RHD genotyping with a specificity and sensitivity comparable to serologic methods is of practical importance to overcome the limitations of serology and, in addition, to improve the currently possible resolution.

The Dc(G48)e(s) haplotype is frequent among the Dce haplotypes within a white population.

BACKGROUND: The absence of hybrid Rhesus boxes denotes an RHD homozygous status and helps to detect the presence of Dce haplotypes instead of dce. RHCE exon 1 C48, characteristic of RHC alleles, and RHCE exon 5 G733, responsible for VS antigenicity, have been noted in many RHce alleles but it was not clearly established whether they occurred in the same allele and/or cosegregate together with RHD. STUDY DESIGN AND METHODS: Samples from 148 white trios (father, mother, and child) were studied. Rh phenotype was performed by hemagglutination. Hybrid Rhesus box, RHCE exon 1 G48C, RHCE exon 5 C733G, and RHC intron 2 polymorphisms were analyzed by polymerase chain reaction. Haplotypes were determined considering serologic, molecular, and segregation data. RESULTS: RHCE exon 1 C48 and RHCE exon 5 G733 were present in RHce alleles that cosegregated with RHD forming Dce haplotypes. Both transversions were not frequently found in the same RHce allele. Of the 33 Dce haplotypes, 16 (48.5%) had a C at position 48 [Dc(C48)e], 11 (33.3%) had a G at position 48 with a G at position 733 [Dc(G48)e(s)], 5 (15.2%) had a G at position 48 [Dc(G48)e], and 1 (3.0%) had a C at position 48 with a G at position 733 [Dc(C48)e(s)]. CONCLUSIONS: The results show four molecular backgrounds for the Dce haplotype and reflect the contribution of African alleles to the genetic pool of the population under study. The molecular characterization of Dce and its frequency distribution may develop a better understanding of the phylogeny of Rh haplotypes.

Estudio de la reactividad antigênica en muestras de sangre congeladas / Study of antigen in frozen blood sample

Se conoce relativamente bien el tiempo de vida útil de muestras de sangre conservadas a bajas temperaturas para uso transfusional. El objetivo de nuestro trabajo fue investigar en muestras de sangre congeladas las modificaciones de la actividad de los antígenos eritrocitarios como reactivos inmunohematológicos. Se estudiaron el antígeno A del sistema ABO y el antígeno D del sistema Rh en sangre de dadores normales (n = 3) utilizando ACD como anticoagulante. Las muestras se fraccionaron en alícuotas que se congelaron inmediatamente. Se determinó el título, el score y la cuantificación de la hemaglutinación a intervalos regulares (7 días). El deterioro del antígeno A sólo es demostrable por la técnica de cuantificación de la hemaglutinación. La pérdida de la reactividad del antígeno D se evidencia en los valores del título y del score, obteniéndose mayor grado de significado al aplicar el método óptico. Además, los resultados obtenidos indican la ventaja del uso de la técnica de cuantificación de la hemaglutinación que puede ser utilizada en laboratorios no especializados

Influencia del genotipo del huesped en la formacion de las metastasis de un linfoma transplantable de rata / Influence of host genotype in the development of metastasis in a transplantable lymphoma in rats

Se estudió el comportamiento de un linfoma transplantable de rata (L-TACB) en tres líneas m, e R y e S con diferente susceptibilidad al tumor y a la frecuencia de metástasis, y en los híbridos mx eR, mx eS y eRx eS. Los tumores de la línea m tuvieron mayor tamño (p < 0,01) que los de eR. Sin embargo, el porcentaje de regresión fue menor (p < 0.001) en eR, evidenciando que la tasa de crecimiento del L-TACB fue independiente de la capacidad de rechazo del tumor. En la línea m y en el híbrido mx eS, apesar de desarrollar tumores muy grandes, sólo un animal de cada grupo tuvo metástasis; en cambio, en la sublínea eR en el híbrido mx eR con tumores de tamaños similares o menortes, la frecuencia de metástasis fue mucho mayor (p < 0,01). La aparición de metástasis estuvo parcialmente asociada al tamaño tumral. Estos resultado sugieren que el crescimiento del L-TACB, la capacidad de rechazo y la formación de metástasis estarían regidos por genes independientes con cierto grado de asociación

Investigación de anticuerpos del sistema ABO en sangre de cordón de recién nacidos: cuantificación de anti-A / Detection of ABO system antibodies in umbilical cord blood from newborn infants: quantitation of anti-A

El objetivo de este trabajo fue determinar la presencia de anticuerpos del sistema ABO em 119 muestras de sangre de cordón de recién nacidos de grupo 0, cuyas madres presentaban el mismo grupo. Posteriormente se titularon los anticuerpos anti-A mediante un método manual de cuantificación de la aglutinación, relacionándolos con los anticuerpos presentes en la madre respectiva. Los resultados obtenidos demuestran la presencia de anticuerpos del sistema ABO en sangre de cordón umbilical en un 93,3% de las muestras (n = 111). Del total de estas muestras con reacción positiva, el 96,4% (n = 107) permaneció activo después del tratamiento con 2-mercaptoetanol, evidenciando su naturaleza de iunmunoglobulina G. La cuantificación de los anticuerpos anti-A demostró una menor concentración en los bebés que en la madre respectiva. Además, se observó que los bebés con títulos altos correspondían a las madres que presentaban títulos mayores. El análisis estadístico (r de Spearman) indicó que existe una asociación entre ambas variables

Efecto de la ciclosfosfamida sobre el crecimiento de un sarcoma transplantable de rata S-E 100 / Effect of cyclophosphamide on a transplantable rat sarcoma S-E 100

La ciclosfosfamida (Cy) se utiliza en el tratamiento del cáncer como droga citotóxica, produciendo grados variables de inmunodepresión. En trabajos experimentales se ha observado que al administrarse en dosis bajas aumenta la respuesta inmune, preferentemente la mediada por células. Este efecto se debería a una acción selectiva sobre los linfocitos T supresores. Con el objeto de investigar la Cy como moduladora de la respuesta inmune antitumoral se estudió el efecto de una dosis única (20 mg/Kg de peso) sobre el crecimiento de un sarcoma transplantable de rata (S-E100). La droga se administró a distintos días del desafío tumoral. Previamente, se evaluó el efecto de la droga sobre el peso del bazo, el número de células esplénicas y la viabilidad de las células S-E100 in vivo ]cámaras de difusión) con el objeto de determinar una dosis que no ejerciera una acción citotóxica inmediata sobre las células esplénicas ni sobre las células tumorales. Los resultados mostraron que una dosis única de 20mg/Kg de peso no modificó el peso del bazo, el número de células esplénicas ni la viabilidad de las células neoplásicas. Esta misma dosis produjó, en cambio, distintos efectos sobre el crcimiento del S-E100 dependidendo del día de su administración. Cuando se administró la Cy a los 7, 14 o 21 días del crcimiento tumoral se obtuvo la regresión del 100% de los tumores. la histopatología de los tumoes en regresión mostró alteraciones compatibles con un rechazo mediado por células

Nuevas estrategias para el análisis genético y molecular del sistema Rh / New strategies for molecular and genetic analysis of Rh system

El locus RH está compuesto, en cada cromosoma de individuos RhD positivo, por dos genes estructurales, adyacentes y homólogos, denominados RHCE y RHD, que codifican las proteínas RhCcEe y RhD respectivamente, mientras que en individuos RhD negativo se encuentra únicamente el gen RHCE. La determinación de las bases moleculares asociadas con los antígenos y fenotipos de este sistema permite investigar el gran polimorfismo del locus RH. El objetivo de este trabajo es estudiar nuevas estrategias para el análisis genético y molecular del sistema Rh. Investigamos la organización genética general del locus RH en individuos pertenecientes a la población de Rosario con distintos fenotipos Rh. En muestras de ADN genómico de dadores voluntarios analizamos dos regiones diferentes del gen RHD mediante el diseño de una estrategia de PCR multiplex basado en el polimorfismo de longitud del intrón 4 y en la presencia de una secuencia específica en la región 3' no codificante del gen RHD. Los resultados obtenidos con esta estrategia molecular presentaron una estricta correlación con los hallados por métodos serológicos. Los estudios realizados en la población analizada en este trabajo indicaron que todos los individuos RhD positivo poseen los dos genes RH, mientras que las personas RhD negativo tendrían solamente el gen RHCE. Se estudiaron 15 muestras RhD positivo débil, observándose siempre el patrón de bandas característico de las muestras RhD positivo. Estos resultados permitieron descartar fenotipos RhD negativo en las muestras con aglutinación muy débil y la presencia, en estos individuos, de genes híbridos responsables del fenotipo D.

Association between immune response and body conformation in the mouse (Mus musculus)

A resposta imune-humoral (HIR) para células vermelhas do sangue de carneiros (SRBC) e o comportamento de um linfoma transplantável de camundongos foram investigados em quatro linhagens de camundongos (CBi+), CBi-, CBi/C e CBi/L) com diferentes estruturas corporais e nas populaçöes base (CBi) das quais estas linhagens derivaram. Camundongos CBi+ (peso alto - rabo longo) e CBi- rabo curto), selecionados para uma correlaçäo fenotípica entre peso corporal e comprimento do rabo, tiveram HIR e SRBC e comportamento tumoral (porcentagem de formaçäo e regressäo de tumores) similares e näo diferem da populaçäo base CBi. Camundongos CBi/C (peso alto - rabo curto) e CBi/L (peso baixo - rabo longo), selecionados para correlaçöes fenotípicas negativas, mostraram diferença significativa entre HIR e SRBC e no comportamento tumoral entre eles e em relaçäo a CBi. Dez dias após o contato antigênico, CBi/C teve os níveis mais altos de hemaglutina (6,49%) para SRBC e uma grande capacidade de rejeiçäo de tumores (97, 2%); CBi/L teve os menores níveis para hemaglutinina (4,75%) e 68% de regressäo de tumores. Camundongos CBi/C e CBi/L tambéem diferem na deposiçäo de gordura, na morfologia do esqueleto, nas propriedades bioquímicas e na qualidade do fêmur. Em vista destes dados e resultados dos experimentos feitos, é sugerido que em seleçäo antagônica, genes que regulam o crescimento, desenvolvimento e resposta imune estäo sujeitos a recombinaçöes. E proposto que a redistribuiçäo de genes aconteceu no cromossomo 17 onde genes que participaram no regulamento do crescimento e desenvovlimento (regiäo T) e resposta imune (completo H-2) estäo próximos

Enfermedad hemolítica fetoneonatal: estudio prenatal del genotipo RHD / Feto-neonatal hemolytic disease: prenatal study of RHD genotype

El objetivo de este trabajo fue determinar la presencia del gen RHD en células fetales obtenidas de líquido amniótico por PCR. Se estudiaron 65 muestras de líquido amniótico, 11 de madres RhD negativas sensibilizadas con anti-D. Se confirmó el origen fetal del ADN analizando un locus VNTR y 3 loci STR en las muestras de ADN de líquido amniótico y sangre materna. En las muestras no contaminadas (n = 62) se realizó la genotipificación RHD utilizando una estrategia de PCR multiplex que permite la obtención de tres productos de amplificación en los fenotipos RhD positivos y sólo un fragmento de ADN en los fenotipos RhD negativos. Se genotipificaron 54 fetos RhD positivos (8 de madres RhD negativas sensibilizadas) y 8 fetos RhD negativos (3 de madres RhD negativas sensibilizadas). La genotipificación del ADN fetal permite diagnosticar con una única amniocentesis fetos en riesgo real de enfermedad hemolítica fetoneonatal y evitar la utilización de métodos invasivos en casos de fetos RhD negativos.