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1.
Rio de Janeiro; s.n; 2019. 126 p. ilus.
Tese em Português | LILACS | ID: biblio-1047207

RESUMO

Esta tese faz uma abordagem in silico e experimental sobre as serina proteases de Leishmania spp. Na primeira etapa do estudo são descritas as serina proteases como parte do degradoma destes parasitos. Os genes de serina protease (n = 26 a 28) em Leishmania spp que codificam proteínas com uma ampla faixa de massa molecular, são descritos juntamente com seus graus de sintenia cromossômica e alélica. Em meio a 17 serina proteases putativas de Leishmania spp apenas 18 % possuem duas funções descritas experimentalmente como propriedades para remover o peptídeo sinal de pro-proteínas secretoras (clã SF), como maturases de outras proteínas (clã SB) e com atividades similares as metacaspase (clã SC). Análises in silico indicaram que o conjunto de serina proteases de Leishmania spp pode estabelecer interrelações funcionais com outras proteínas de Leishmania spp significando atuações essenciais na fisiologia do parasito. Padrões de redes distintos podem ocorrer e a complexidade destas redes difere entre as espécies relacionadas ao subgênero Viannia e Leishmania: Leishmania (V.) braziliensis (n = 215); Leishmania (L.) mexicana (n = 130); L. (L.) donovani (n=56) Leishmania (L.) major (n = 45); Leishmania (L.) infantum (n = 23). O fato das serina proteases de L. (V.) braziliensis indicarem mais possibilidades de interações com outras proteínas do parasito foi a motivação para segunda etapa deste estudo


Esta etapa consistiu em uma abordagem experimental e in silico investigando as serina proteases deste parasito, incluindo atividade enzimática de serina proteases de frações subcelulares obtidas por cromatografia de afinidade com benzamidina, reações em cadeia da polimerase com transcrição reversa e ensaios in silico de localização subcelular de subtilisinas. Promastigotas apresentaram serina proteases com atividade gelatinolítica na fração citosólica (43 kDa a 170 kDa) e na fração membrana (67 kDa a 170 kDa). Ambas as frações também demostraram propriedades de catálise sobre os substratos peptídicos N-benziloxicarbonil-L-fenilalanil-L-arginina 7-amino-4-metilcumarina (fração citosólica = 392 ± 30 mol.min-1 mg of protein-1; fração de membrana = 53 ± 5 mol.min-1 mg of protein-1) e N-succinil-L-alanina-L-fenilalanina-L-lisina 7-amino-4-metilcumarina (fração citosólica = 252 ± 20 mol.min-1 mg of protein-1; fração de membrana = 63.6 ± 6.5 mol.min-1 mg of protein-1) com diferentes perfis de especificidade demonstrada pela inibição com aprotinina (19 % a 80 %) e fluoreto de fenilmetilsulfonil (3 % a 69 %), dependendo da fração subcelular e do substrato. A expressão dos genes das subtilisinas (LbrM.13.0860 e LbrM28.270) e da triparedoxina peroxidase (LbrM.15.1080) também foram observadas, com a detecção dos transcritos de 200 pb, 162 pb e 166 pb, respectivamente. Ensaios subsequentes indicaram que a enzima codificada pelo gene LbrM.13.0860 tem localização no citosol e a codificada pelo gene LbrM.28.2570 na membrana do parasito. Coletivamente, os dados aqui obtidos indicam relevantes contribuições das serina proteases na fisiologia da Leishmania spp, incluindo as subtilisinas das promastigotas de L. (V.) braziliensis. (AU)


Assuntos
Subtilisina , Serina Proteases , Leishmania
2.
Pesqui. vet. bras ; 36(8): 711-718, Aug. 2016. tab, graf, ilus
Artigo em Inglês | LILACS, VETINDEX | ID: lil-797989

RESUMO

The protein profiles and proteolytic activity of the excretory secretory products (E/SP) of the first (L1), second (L2) and third (L3) larval stages of Cochliomyia hominivorax were studied in the laboratory. Analysis on the E/SP protein profile was carried out using polyacrylamide gel containing sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE). The E/SP of each larval stage (L1, L2 and L3) treated with protease inhibitors, containing 30µg, 40µg and 50µg of protein, was applied to the 10% polyacrylamide gel. The proteolytic activity of the crude E/SP was analyzed in gels copolymerized with gelatin and by colorimetric assays using azocasein as a substrate, with the characterization of the proteases using synthetic inhibitors. Different protein profiles were observed for the larval instars, with L1 presenting the most complex profile. Nevertheless, various protein bands were observed that were common to all the larval instars. The E/SP of all the instars showed proteolytic activity on gelatin, evidenced by proteolysis zones, predominantly with apparently higher molecular masses in L1, while for L2 and L3 the proteolysis zones could also be observed in regions with lower masses. Tests with protease inhibitors using gelatin as substrate showed that the E/SP of larvae were mainly composed of serine proteases. Additionally, inhibition was observed in L2 E/SP treated previously with EDTA, an inhibitor of metalloproteases. The assays with azocasein revealed a gradual increase of proteolytic activity on this substrate with larval development progress, with the strongest inhibitions being observed after treatments with 3,4-dichloroisocoumarin (DCI) for E/SP of L1, L2 and L3. These results suggest that C. hominivorax larvae produce different proteases, a fact that can be related to the parasite's vital processes for survival, such as penetration into the host's tissues and nutrition during the larval stage.(AU)


Os perfis protéicos e a atividade proteolítica dos produtos de excreção/secreção (PE/S) das larvas de primeiro (L1), segundo (L2) e terceiro (L3) estágios de Cochliomyia hominivorax foram estudados em laboratório. Os perfis protéicos foram obtidos por eletroforese em géis de poliacrilamida (SDS-PAGE). Os PE/S de cada fase larval (L1, L2 e L3), tratados com inibidores de proteases, contendo 30µg, 40µg e 50µg de proteína, foram aplicados em géis de poliacrilamida a 10%. A atividade proteolítica dos PE/S na sua forma nativa, foi analisada em géis co-polimerizados com gelatina e por testes colorimétricos usando a azocaseína como substrato, com a caracterização das proteases feita por meio de inibidores sintéticos. Diferentes perfis protéicos foram observados para os instares larvais, com L1 apresentando o perfil mais complexo. Apesar disso, foram observadas várias bandas protéicas comuns a todos os estágios larvais. Os PE/S de todos os instares mostraram atividade proteolítica sobre a gelatina, evidenciada por zonas de proteólise, com predominância de massas moleculares aparentes mais altas em L1, enquanto que para L2 e L3 as zonas de proteólise puderam ser observadas também em regiões de menores massas. Os testes com inibidores de proteases usando a gelatina como substrato mostraram que os PE/S de L1, L2 e L3 eram compostos principalmente de serina-proteases. Adicionalmente, inibição foi observada nos PE/S de L2 tratada previamente com EDTA, um inibidor de metalo-proteases. Os ensaios com a zocaseína revelaram um aumento gradual da atividade proteolítica sobre este substrato com o progresso do desenvolvimento larval, com a mais forte inibição sendo observada após o tratamento com 3,4 dicloroisocumarina (DCI) para os PE/S de L1, L2 e L3. Estes resultados sugerem que as larvas de C. hominivorax produzem diferentes proteases, fato que pode estar relacionado a processos vitais para a sobrevivência do parasita, tais como a penetração nos tecidos dos hospedeiros e nutrição durante os estágios larvais.(AU)


Assuntos
Animais , Dípteros , Larva/fisiologia , Peptídeo Hidrolases/análise , Serina Proteases , Eletroforese em Gel de Poliacrilamida , Miíase/veterinária , Inibidores de Proteases
3.
Braz. j. microbiol ; 44(4): 1299-1304, Oct.-Dec. 2013. ilus
Artigo em Inglês | LILACS | ID: lil-705290

RESUMO

Halophilic microorganisms are source of potential hydrolytic enzymes to be used in industrial and/or biotechnological processes. In the present study, we have investigated the ability of the moderately halophilic bacterium Halobacillus blutaparonensis (strain M9), a novel species described by our group, to release proteolytic enzymes. This bacterial strain abundantly proliferated in Luria-Bertani broth supplemented with 2.5% NaCl as well as secreted proteases to the extracellular environment. The production of proteases occurred in bacterial cells grown under different concentration of salt, ranging from 0.5% to 10% NaCl, in a similar way. The proteases secreted by H. blutaparonensis presented the following properties: (i) molecular masses ranging from 30 to 80 kDa, (ii) better hydrolytic activities under neutral-alkaline pH range, (iii) expression modulated according to the culture age, (iv) susceptibility to phenylmethylsulphonyl fluoride, classifying them as serine-type proteases, (v) specific cleavage over the chymotrypsin substrate, and (vi) enzymatic stability in the presence of salt (up to 20% NaCl) and organic solvents (e.g., ether, isooctane and cyclohexane). The proteases described herein are promising for industrial practices due to its haloalkaline properties.


Assuntos
Halobacillus/enzimologia , Serina Proteases/análise , Meios de Cultura/química , Estabilidade Enzimática , Inibidores Enzimáticos/metabolismo , Concentração de Íons de Hidrogênio , Halobacillus/crescimento & desenvolvimento , Peso Molecular , Proteólise , Fluoreto de Fenilmetilsulfonil/metabolismo , Serina Proteases/química , Cloreto de Sódio/metabolismo
4.
São Paulo; s.n; 2013. [71] p. tab.
Tese em Português | LILACS, Sec. Est. Saúde SP, SESSP-CTDPROD, Sec. Est. Saúde SP, SESSP-ACVSES, SESSP-TESESESSP, Sec. Est. Saúde SP | ID: lil-691498

RESUMO

O envenenamento ofídico representa uma questão de saúde para vários países do mundoe alguns fatores importantes devem ser levados em consideração a fim de minimizareste problema como, por exemplo, atendimento médico de qualidade e um melhor registro de acidentes. O gênero Bothrops é considerado o mais importante nos casos deenvenenamento ofídico no Brasil e, como outras serpentes, seu veneno é uma mistura complexa de componentes que agem em diferentes alvos na presa/vítima. Considerandoque as enzimas proteolíticas das classes das metalopeptidases e as serinopeptidases (cerca de 65 % da composição do veneno) são as principais toxinas do veneno da B.jararaca, as mesmas foram escolhidas no presente estudo para se determinar o nível de neutralização das suas atividades pelo soro produzido pelo Instituto Butantan, o qual éamplamente utilizado no Brasil. Para isso dois substratos FRETs foram selecionados, a partir de uma biblioteca de peptídeos, que se comportaram como alvos seletivos para as serino- e metalopeptidases. Desta maneira, observamos que o soro é ineficiente no bloqueio da atividade de duas serinopeptidases e, este fato nos levou à busca dos motivos pelos quais o soro antibotrópico comercial estaria apresentando esta falha. Assim, estas duas serinopeptidases ainda inéditas no veneno de Bothrops jararaca e não neutralizadas pelo soro comercial foram purificadas e identificadas e verificamos que a razão na falha do soro comercial em bloquear estas atividades é ausência de anticorpos específicos contra estas enzimas já que as mesmas não eram reconhecidas pelo soro no ensaio de western blot. Assim, nossos resultados indicam uma possível falha na composição do soro antibotrópico, portanto fomos levados a estudar mais profundamente o papel destas serinopeptidases e buscamos novos substratos para estasenzimas...


Assuntos
Animais , Bothrops , Metaloproteases , Peptídeos , Serina Proteases , Soro , Venenos de Serpentes
5.
São Paulo; s.n; 2011. 142 p. ilus, tab, mapas, graf.
Tese em Português | LILACS, Sec. Est. Saúde SP, SESSP-CTDPROD, Sec. Est. Saúde SP, SESSP-ACVSES, SESSP-TESESESSP, Sec. Est. Saúde SP | ID: lil-641181

RESUMO

As serinoproteases e metaloproteases são as principais enzimas do veneno de Bothrops jararaca, elas agem sobre as proteínas dos tecidos das vítimas ou presas, e como resultado de suas ações diretas, essas proteases podem gerar peptídeos com ações específicas em células ou ainda afetar mecanismos fisiológicos. As fontes mais comuns de peptídeos bioativos são as proteínas precursoras naturais. No entanto, estudos recentes têm mostrado que existem outras fontes de peptídeos bioativos, as cripteínas, que fazem parte de uma nova classe de proteínas que não são consideradas precursoras, mas sob certas condições, originam peptídeos bioativos, assim eles são denominados criptídeos. Os criptídeos podem provocar efeitos relevantes na questão do envenenamento, causando efeitos secundários ou indiretos. Neste trabalho, esses criptídeos gerados pela ação das serinoproteases do veneno e pela ação da tripsina sobre substratos endógenos, foram isolados, e em seguida foram caracterizados bioquimicamente e biologicamente de acordo com suas ações em células. As serinoproteases do veneno de B. jararaca foram separadas do veneno total utilizando CLAE com uma coluna de exclusão molecular, estas serinoproteases foram então incubadas com o substrato mioglobina. Como também foi utilizado a tripsina, foram escolhidos os seguintes substratos, mioglobina, hemoglobina, immunoglobulina G e colágeno, que foram incubados com a tripsina.Os criptídeos gerados foram separados por fracionamento por CLAE e as frações foram testadas em culturas de células para observar efeitos citotóxicos ou proliferativos. As frações ativas foram repurificadas para obter criptídeos puros. Com a atividade desses criptídeos confirmada, estes foram sequenciados e sintetizados. A ação da tripsina sobre a mioglobina gerou criptídeos (ALELFR, TGHPETLEK, GLSDGEWQQVLNVWGK) que apresentaram atividade proliferativa em células do tipo fibroblastos e endoteliais. Utilizando um programa de bioinformática, Cn3D, observou-se...


Assuntos
Animais , Bothrops , Peptídeos , Serina Proteases , Venenos de Serpentes
6.
Biol. Res ; 44(2): 145-150, 2011. ilus
Artigo em Inglês | LILACS | ID: lil-602970

RESUMO

The interaction between acrosome-reacted sperm and zona pellucida proteins is not yet fully understood. Serine protease acrosin and its zymogen proacrosin have been proposed to fulfill this function due to their capacity to bind zona pellucida glycoproteins. However, the molecular mechanism underlying this interaction has been merely speculative. Here we show that fucoidan (a sulfated polysaccharide) and solubilized zona pellucida glycoproteins, but not soybean trypsin inhibitor, are able to detach bound spermatozoa, which suggests that live sperm binds to the zona pellucida in a non-enzymatical way. Interestingly, mild proteolytic digestion with acrosin or trypsin does not modify the structure of the zona pellucida, but rather results in fewer spermatozoa binding to the zona. These results agree with a model where the active site of acrosin digests the zona pellucida and binds through the polysulfate-binding domain through a three-dimensional zona structure rather than a single ligand.


Assuntos
Animais , Cricetinae , Masculino , Acrosina/metabolismo , Reação Acrossômica/fisiologia , Serina Proteases/metabolismo , Espermatozoides/enzimologia , Zona Pelúcida/metabolismo , Espermatozoides/fisiologia
7.
Braz. j. med. biol. res ; 32(5): 645-9, May 1999.
Artigo em Inglês | LILACS | ID: lil-233483

RESUMO

We have characterized, in the Paracoccidioides brasiliensis yeast phase, an exocellular SH-dependent serine proteinase activity against Abz-MKRLTL-EDDnp and analogous fluorescent-quenched peptides, and showed that it is also active against constituents of the basement membrane in vitro. In the present study, we separated the components of P. brasiliensis culture filtrates by electrophoresis and demonstrated that the serine-thiol exocellular proteinase has a diffuse and heterogeneous migration by SDS-PAGE, localizing in a region between 69 and 43 kDa. The hydrolytic activity was demonstrable after SDS-PAGE using buffered agarose overlays of Abz-MKALTLQ-EDDnp, following incubation at 37oC, and detection of fluorescent bands with a UV transilluminator. Hydrolysis was more intense when incubation was carried out at basic pH, and was completely inhibited with 2.5 mM PMSF and partially with sodium 7-hydroxymercuribenzoate (2.5 mM p-HMB), suggesting its serine-thiol nature. A proteolytic band with similar characteristics was observed in conventional gelatin zymograms, but could not be correlated with a silver-stained component. Detection of the serine-thiol proteinase in substrate gels after SDS-PAGE provides a useful way of monitoring purification of the basement membrane degrading enzyme


Assuntos
Membrana Basal/metabolismo , Eletroforese em Gel de Poliacrilamida , Paracoccidioides/enzimologia , Serina Proteases/metabolismo , Eletroforese em Gel de Ágar , Serina Proteases/química
8.
Medicina (B.Aires) ; 58(3): 262-4, 1998. tab
Artigo em Inglês | LILACS | ID: lil-213399

RESUMO

In order to study the colonic intraluminal proteinase-antiproteinase imbalance under inflammatory conditions, we determined proteolytic activity (PA), alpha-1-antitrypsin and the activities of trypsin, chymotrypsin and neutrophil elastase in feces from patients with ulcerative colitis (UC) comparing the results with a control group. A fecal sample was obtained from each of 25 patients with ulcerative colitis and 10 control subjects were studied. The severity of the disease was assessed by the Truelove index. Proteolytic activity was measured lesing azocasein as proteolytic substrate. The fecal concentration of alpha-1-antitrypsin was measured by radial immunodiffusion and the activities of the enzymes were measured using specific substrates. We found an increase in fecal PA, alpha-1-antitrypsin and neutrophil elastase in patients with UC and the correlation between the severity of the disease and the PA was statistically significant (r = 0.62, P < 0.05). We conclude that elevated colonic proteinase activity could contribute to the pathophysiology of ulcerative colitis.


Assuntos
Humanos , alfa 1-Antitripsina/análise , Colite Ulcerativa/enzimologia , Serina Proteases/metabolismo , Quimotripsina/metabolismo , Colite Ulcerativa/fisiopatologia , Elastase Pancreática/metabolismo , Estatísticas não Paramétricas , Tripsina/metabolismo
9.
P. R. health sci. j ; 16(4): 369-73, Dec. 1997. tab, graf
Artigo em Inglês | LILACS | ID: lil-212072

RESUMO

The objectives of this study is to determine if periodontitis-related ANCA hinder the accurate estimation of this kind of autoantibodies in systemic lupus erythematosus (SLE), due to the frequent coexistence of SLE and periodontitis, and the high incidence of antineutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA) in this periodontal condition. Thirty SLE, thirty periodontitis lacking systemic involvement patients, and twenty healthy controls were utilized in this study. The periodontal condition and the presence of ANCA in sera of all individuals was carefully evaluated. For ANCA determination an EIA essay was utilized, directed to a neutrophil granular extract and six neutrophil granule proteins. Sixty percent of SLE patients had periodontitis, and sixty-five percent were ANCA positive. Eighty three percent of all ANCA cases were coexisting with periodontitis. A significant association (p > 0.005) between periodontitis and ANCA was found (Chi Square Test). Fifty percent of the patients with periodontitis lacking systemic involvement were ANCA positive. The results obtained in this study suggest that the figures of ANCA previously reported for SLE, might be overestimated due to the inadvertent presence of periodontitis


Assuntos
Humanos , Masculino , Feminino , Adolescente , Adulto , Pessoa de Meia-Idade , Anticorpos Anticitoplasma de Neutrófilos/análise , Lúpus Eritematoso Sistêmico/complicações , Lúpus Eritematoso Sistêmico/imunologia , Periodontite/complicações , Autoantígenos/imunologia , Distribuição de Qui-Quadrado , Técnicas Imunoenzimáticas , Lactoferrina/imunologia , Periodontite/diagnóstico , Periodontite/imunologia , Projetos Piloto , Serina Proteases/imunologia
10.
Braz. j. med. biol. res ; 30(10): 1157-62, Oct. 1997. ilus, tab
Artigo em Inglês | LILACS | ID: lil-201531

RESUMO

Two intramolecularly quenched fluorogenic peptides containing oaminobenzoyl (Abz) and ethylenediamine 2,4-dinitrophenyl (EDDnp) groups at amino- and carboxyl-terminal amino acid rsidues, Abz-Darg-Arg-Leu-EDDnp (Abz-DRRL-EDDnp) and Abz-DArg-Arg-Phe-EDDnp (Abz-DRRF-EDDnp), were selectively hydrolyzed by neutral endopeptidase (NEP, enkephalinase, neprilysin, EC 3.4.24.11) at the Arg-Leu and Arg-Phe bonds, respectively. The kinetic parameters for the NEP-catalyzed hydrolysis of Abz-DRRL-EDDnp and Abz-DRRF-EDDnp were Km = 2.8muM, Kcat = 5.3 min-1, Kcat/Km = 2 min-1 muM-1 and Km = 5.0 muM, Kcat = 7.0 min-1, Kcat/Km = 1.4 min-1 muM-1, respectively. The high specificity of these substrates was demonstrated by their resistance to hydrolysis by metalloproteases [thermolysin (EC 3.4.24.2), angiotensin-converting enzyme (ACE;EC 3.4.24.15)], serineproteases [trypsin (EC 3.4.21.4), alpha-chymotrypsin (EC 3.4.21.1)] and proteases present in tissue homogenates from kidney, lung, brain and testis. The blocked amino- and carboxyl-terminal amino acids protected these substrates against the action of aminopeptidases, carboxypeptidases and ACE. Furthermore, DR amino acids ensured total protection of Abz-DRRL-EDDnp and Abz-DRRF-EDDnp against the action of thermolysin and trypsin. Leu-EDDnp and Phe-EDDnp were resistant to hydrolysis by alpha-chymotrypsin. The high specifity of these substrates suggests their use for specific NEP assays in crude enzyme preparations.


Assuntos
Ratos , Animais , Técnicas In Vitro , Metaloproteases , Neprilisina/fisiologia , Serina Proteases , Substratos
11.
Salvador; s.n; 1997. vii,54 p. ilus, tab.
Tese em Português | LILACS | ID: lil-238949

RESUMO

Os leucócitos polimorfonucleares têm papel crítico na destruiçäo, digestäo de patógenos, geraçäo e regulaçäo do processo inflamatório. Proteínas que säo estocadas dentro dos grânulos citoplasmáticos têm sido implicadas nos mecanismos microbicidas, independentes de oxigênio, bem como na degradaçäo de proteínas. Os grânulos azurófilos e específicos de polimorfonucleares neutrófilos contêm pelo menos 10 proteínas que podem destruir microorganismos. Dentre estas proteínas, 3 säo serina proteinases: catepsina G, proteinase 3 e elastase. Estas serina proteinases têm atividade antibiótica e também degradam proteínas do tecido conjuntivo. Azurocidina apresenta diversas semelhanças na sequência de aminoácidos e de DNA com as serina proteinases, também possui atividade antibiótica, porém näo apresenta atividade proteolítica, devido a mutaçäoes ocorridas na molécula de DNA, alterando o sítio catalítico típico desta família de proteínas. Esta família de proteínas, incluindo a azurocidina, é denominada de serprocidinas (serina proteinases com atividade microbicida). Azurocidina tem peso molecular de 29 kD e seu DNA codifica 225 aminoácidos da proteína madura e 24 resíduos de aminoácidos do sinal peptídico. O presente trabalho de tese diz respeito à expressäo e produçäo de azurocidina recombinante no sistema de expressäo baculovírus-células de inseto. Azurocidina recombinante expressada e produzida neste sistema foi caracterizada bioquimicamente e sua atividade microbicida conta bactérias Gram negativas e Gram positivas, bem como contra fungo, foi demonstrada. Azurocidina recombinante possui similaridades com a molécula nativa no peso molecular, 29 kD, padräo de glicosilaçäo, ambas possuem manose como resíduo de açucar terminal, sequência N-terminal de aminoácidos e com a atividade microbicida. A LD50 de azurocidina recombinante comtra E. coli, S. faecalis e C. albicans foi 1,2 (mais ou menos) 0,1, 2,9 (mais ou menos) 0,4 e 8,2 (mais ou menos) 0,2 ug/ml, respectivamente e a LD50 de azurocidina nativa foi de 1,3 (mais ou menos) 0,05, 2,3 (mais ou menos) 0,2 e 8 (mais ou menos) 0,8 ug/ml. Também foi demonstrado, com experimentos de deleçäo na molécula de DNA de azurocidina, que as sequências de aminoácidos localizadas entre as posiçöes 114 a 129 e/ou entre 154 a 186, säo necessárias para que azurocidina recombinante seja secretada pelo mio de cultura das células de inseto infectadas com o baculovírus recombinante. Associado a este trabalho de tese, desenvolvemos...


Assuntos
Neutrófilos/metabolismo , Proteínas Recombinantes , Serina Proteases/efeitos adversos , Serina Proteases/uso terapêutico , Bactérias Gram-Negativas/genética , Bactérias Gram-Positivas/genética , Baculoviridae/isolamento & purificação , Regulação Bacteriana da Expressão Gênica , Proteínas de Bactérias/metabolismo
12.
Niterói; s.n; 1997. 818 p. ilus, tab.
Tese em Português | LILACS | ID: lil-682584

RESUMO

Duas toxinas foram purificadas do veneno de Lachesis muta rhombeata com uma rendimento de aproximadamente 74 a 76%, empregando uma etapa de focalização isoelétrica preparativa seguida por gel filtração (HPLC)...Quando injetada em camundongos (0,25 ug/g), a LMR 47 induziu episódios de opistótono e giros, evidenciando a atividade giroxina. A análise histopatológica mostrou microhemorragias focais e outras alterações celulares a nível do cerebelo. A injeção intraplantar de 10ug da proteína, LMR 32, em camundongos induziu um incremento do volume (edema) de 45% e a inoculação de 0,1 e 0,25 ug/g da mesma proteína em ratos causou uma queda significativa na pressão arterial.


Assuntos
Animais , Camundongos , Calicreínas , Lachesis muta , Camundongos , Serina Proteases , Venenos de Serpentes
13.
Braz. j. med. biol. res ; 29(6): 773-7, jun. 1996. tab
Artigo em Inglês | LILACS | ID: lil-181412

RESUMO

The IgM-PK-ELISA, an enzyme-linked immunosorbent assay for immunoglobulin M employing a proteinase K-treated antigen, and the "Leptoteste-S" macroagglutination test were evaluated for use in a rapid serodiagnosis of human leptospirosis. The microscopic agglutination test (MAT) was used as reference. The three serological tests were applied to serum samples from patients with leptospirosis (N=89), typhoid fever (N=8), malaria (N=19), syphilis (N=20), hepatitis (N=16) and from clinically healthy donors (N=92). The overall results of the IgM-PK-ELISA and the "Leptoteste-S"are comparable to those of the MAT. However, both tests differed statistically from MAT in terms of the positivity of the acute-phase sera, with approximately 38 per cent of the patients with leptospirosis being identified earlier than when MAT was used. The IgM-PK-ELISA, with 89,9 per cent sensitivity and 97,4 per cent specificity, could be the test of choice for those laboratories which are equipped to perform ELISA. The "Leptoteste-S", with 89.9 per cent sensitivity and 94.8 per cent specificity, seems to be easier to perform and the most accessible to peripheral laboratories for rapid screening of human sera. Both techniques present the important characteristic of detecting early antibodies against leptospires, thus providing a diagnosis during the early stages of the disease.


Assuntos
Humanos , Leptospirose/diagnóstico , Ensaio de Imunoadsorção Enzimática , Estudo de Avaliação , Imunoglobulina M , Sensibilidade e Especificidade , Serina Proteases , Testes de Aglutinação/métodos
14.
Acta cient. venez ; 47(1): 67-73, 1996. tab, graf
Artigo em Espanhol | LILACS | ID: lil-217037

RESUMO

A proteolytic enzyme from the venom of Bothrops atrox snake was isolated. It was designed as Atroxin, and three chromatography steps were used to purification: ion exchange chromatography on DEAE-Sephadex A-50 equilibrated with 0.05 M Tris HCl buffer, 1 mM CaCl2 pH 7.4, followed by gel filtration on Sephadex G-50 andSephadex G-100, respectively, using the same buffer. The enzyme was recovered with a 7.4 folds and 11 percent of yield. It had a high activity on casein being 7.4 optimus pH. A molecular weight was 19.9 Kd calculated by polyacrilamide gel electrophoresis, and head treatment showed that the enzyme preserves its activity in the range of 37-45 degrees C, while it was decrease when the temperature values were higher. On the other hand, 0.133 mumoles of Ca2+ and Mg2+, and Zn2+ ions (0.266 mumoles) were activators, while EDTA (0.20 mumoles) and sodium azide (0.053 mumoles) were inhibitors. The enzymatic activity was not affected by glicerol(1.33 mumoles) and phenyl methyl sulphonyl fluoride(PSMF) (0.16 mumoles). In addition, iodoacetic acid (0.08 mumoles) was slight inhibitor, but 0.16 mumoles of p-tosyl-1-lysine chloromethyl ketone (TLCK) was activator. Biological assays on mice showed that atroxin produced hemorrhagic and necrosis after 24 h of injection, which was increased by 5 mM calcium chloride


Assuntos
Animais , Camundongos , Bothrops , Serina Proteases/isolamento & purificação , Venenos de Crotalídeos/enzimologia , Venenos de Crotalídeos/toxicidade
15.
Braz. j. med. biol. res ; 27(12): 2821-30, Dec. 1994. tab
Artigo em Inglês | LILACS | ID: lil-153281

RESUMO

1. Heart mass, prolyl endopeptidase activity and fractionated proteins from heart tissue were studied in one-kidney, one clip hypertensive rats (N=6) and compared to sham-operated rats (N=6). 2. Body weigh, arterial pressure and tissue mass were measured 4 weeks after artery clipping Z-Gly-Pro-p-nitroaniline hydrolysis was used to measure tissue prolyl endopeptidase activity in the homogenate. Protein was fractionated into the soluble and myofibrillar fractions. 3. In the normotensive rats, prolyl endopeptidase activity expressed in terms of protein specific activity (µM substrate hydrolyzed h-1 mg supernatant protein-1) occurred in atria and was 2.5-fold higher than in the ventricles (3.79 ñ 0.20 vs 1.44 ñ 0.02, P<0.05). In the one-kidney, one clip hypertensive rats, the left ventricle tissue increased 1.7-fold (2.27 ñ 0.11 vs 3.72 ñ 0.11 mg wet weight tissue/g body weight, P<0.001), the soluble protein fraction (54.86 ñ 3.60 vs 57.38 ñ 6.64 mg/g wet weight tissue) was unchanged, while the myofibrillar fraction increased 1.9-fold (118.9 ñ 9.09 vs 229.8 ñ 8.47 mg/g wet weight tissue, P<0.001). 4 The specific activity of the atrial and ventricular prolyl endopeptidase decreased in atria and increased in ventricles as the result of hypertension (3.79 ñ 0.2 vs 2.84 ñ 0.13 and 1.44 ñ 0.02 vs 1.87 ñ 0.13; respectively). These regional differences in prolyl endopeptidase enxyme content caused by one-kidney, one clip hypertension in neurosecretory and non-neurosecretory heart areas suggest that this enzyme plays a local role in the turnover of specific polypeptides


Assuntos
Animais , Masculino , Ratos , Hipertensão Renovascular/enzimologia , Miocárdio/enzimologia , Serina Proteases/metabolismo , Análise de Variância , Ratos Wistar
16.
Braz. j. med. biol. res ; 27(2): 363-7, Feb. 1994.
Artigo em Inglês | LILACS | ID: lil-140276

RESUMO

Three enzymes have been described in malaria merozoites: a serine-protease and two phospholipases. The parasite serine-protease is necessary for parasite entry into the red blood cell. This enzyme is synthesized by intraerythrocytic schizonts as a glycolipid-anchored membrane precursor, harbouring a performed serine-protease active site but not detectable proteolytic activity. Detection of the enzymatic activity correlates with the solubilisation of the enzyme by a parasite glycolipid-specific phospholipase C in merozoites. A third enzyme has been detected with glycolipid-degrading activity, presumably a lipase A. These activities participate in a biochemical cascade originating with the attachment of the merozoite to the red blood cell, including the translocation of the phospholipase C to the membrane-bound protease, the solubilisation/activation of the protease and its secretion at the erytrocyte/parasite junction and ending with the entry of the parasite into the host cell. Both the phospholipase C and the lipase A might generate secondary messages in the merozoite. Our current knowledge concerning these enzymes is presented


Assuntos
Eritrócitos , Lipase/metabolismo , Malária/enzimologia , Serina Proteases/metabolismo , Fosfolipases Tipo C/metabolismo , DNA , Ácidos Graxos , Fosfatidilinositóis/metabolismo , Glicolipídeos/metabolismo , Microscopia Eletrônica , Plasmodium falciparum
18.
Braz. j. med. biol. res ; 26(1): 15-29, Jan. 1993. tab, graf
Artigo em Inglês | LILACS | ID: lil-148669

RESUMO

1. A kinin-inactivating chymotrypsin-like serine-endopeptidase was purified 202-fold from human urine by DEAE-cellulose chromatography, gel filtration, DEAE/HPLC chromatography and affinity chromatography. It hydrolyzed bradykinin at the Phe5-Ser6 peptide bond at a rate of 1.090 mumol min-1 mg protein-1 at pH 8.0 and 37 degrees C. The molecular weight of this endopeptidase H2, estimated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and by gel filtration, was 60 kDa, and its optimum pH for bradykinin hydrolysis was near 8.5. 2. Bradykinin inactivating activity was inhibited 100 per cent by the serine-proteinase inhibitor PMFS (1 mM) and the chymotrypsin inhibitor TPCK (5 mM). Reagents such as 2-mercaptoethanol (3 mM) and pOH-mercuribenzoate (3 mM) inhibited the enzyme by 100 per cent and 67 per cent , respectively. 3. Endopeptidase H2 hydrolyzes the Phe-Ser bond of peptides related to bradykinin and its activity appears to be limited to peptide chains of < or = 18 amino acid residues since it does not hydrolyze BAM 22, peptide E or kininogen. 4. The molecular size and inhibition profile suggested that endopeptidase H2 differs from the serine-proteinases previously described in rat liver, rat hepatic endothelium, rat and rabbit brain. 5. The physiological role of endopeptidase H2 may be a link between the kinin and neuropeptide systems in the control of water-electrolyte balance


Assuntos
Humanos , Animais , Cães , Cobaias , Serina Proteases/isolamento & purificação , Bradicinina/metabolismo , Cromatografia Líquida , Eletroforese em Gel de Poliacrilamida , Concentração de Íons de Hidrogênio , Cininas/antagonistas & inibidores , Peso Molecular , Serina Proteases/efeitos dos fármacos , Serina Proteases/urina , Fatores de Tempo , Equilíbrio Hidroeletrolítico
19.
Braz. j. med. biol. res ; 20(6): 767-70, 1987. ilus
Artigo em Inglês | LILACS | ID: lil-77435

RESUMO

Two types inhibitors were prufied from Enterolobium contortisiliquum beans. The inhibitor of serine-proteinases inhibited trypasin (Ki = 5 nM) chymostrypsin (Ki = 10 nM) and plasma kallikrein, but not tissue kallikreins. The molecular weight is approximately 23 KDal and two polypeptide chains detected after reduction. The second inhibitor with activity directed against SH-proteinase was isolated by CM-papain-Sepharose. The molecular weight is approximately 60 KDal and only one polupeptide chain was detected after reduction. Papain (Ki = 0.6 nM) and bromelain are inhibited


Assuntos
Fabaceae , Inibidores de Proteases/isolamento & purificação , Serina Proteases/antagonistas & inibidores
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