Characterization of Staphylococcus spp. strains in milk from buffaloes with mastitis in Brazil: the need to identify to species level to avoid misidentification / Caracterização de cepas de Staphylococcus spp. isoladas de leite de búfalas com mastites em Brasil: a necessidade de se identificar até nível de espécie para evitar erros de identificação

Mastitis is an inflammation of the mammary gland that affects dairy cattle worldwide causing economic losses. Coagulase-negative staphylococci (CNS) are the predominant cause of this type of infection. We have recently showed that coagulase-positive staphylococci could be misidentified. So, the aim of this study was to characterize the Staphylococcus spp. strains initially classified as coagulase-negative Staphylococci, isolated from buffalo with subclinical mastitis. Milk of buffaloes with mastitis in herds was collected and 9 strains were identified as CNS by phenotypic tests. Molecular methodologies latter identified the strains as coagulase-negative Staphylococcus chromogenes (5), coagulase-positive Staphylococcus hyicus (2) and coagulase-positive Staphylococcus aureus (2). Our results strongly support the need to identify the isolates to a species level in order to avoid misidentification and to be aware of the classification using the coagulase test alone.(AU)

A mastite é uma inflamação da glândula mamária que afeta o gado leiteiro em todo o mundo, causando perdas econômicas. Staphylococcus coagulase-negativa (SCN) são a causa predominante desse tipo de infecção. Mostrou-se recentemente que Staphylococcus coagulase-positiva podem ser identificados erroneamente. Assim, o objetivo deste estudo foi caracterizar cepas de Staphylococcus spp. inicialmente classificados como Staphylococcus coagulase-negativa, isolados de búfalas com mastite subclínica. O leite de búfalas com mastite foi coletado, e nove cepas foram identificadas como SCN por testes fenotípicos. Metodologias moleculares identificaram as cepas como Staphylococcus chromogenes coagulase-negativa (5) Staphylococcus hyicus coagulase-positiva (2) e Staphylococcus aureus coagulase-positiva (2). Os resultados reforçam a necessidade de identificar as cepas em termos de espécie, a fim de se evitarem erros de identificação e estar atento à classificação utilizando o teste de coagulase sozinho.(AU)

Characterization of Staphylococcus spp. strains in milk from buffaloes with mastitis in Brazil: the need to identify to species level to avoid misidentification / Caracterização de cepas de Staphylococcus spp. isoladas de leite de búfalas com mastites em Brasil: a necessidade de se identificar até nível de espécie para evitar erros de identificação

Mastitis is an inflammation of the mammary gland that affects dairy cattle worldwide causing economic losses. Coagulase-negative staphylococci (CNS) are the predominant cause of this type of infection. We have recently showed that coagulase-positive staphylococci could be misidentified. So, the aim of this study was to characterize the Staphylococcus spp. strains initially classified as coagulase-negative Staphylococci, isolated from buffalo with subclinical mastitis. Milk of buffaloes with mastitis in herds was collected and 9 strains were identified as CNS by phenotypic tests. Molecular methodologies latter identified the strains as coagulase-negative Staphylococcus chromogenes (5), coagulase-positive Staphylococcus hyicus (2) and coagulase-positive Staphylococcus aureus (2). Our results strongly support the need to identify the isolates to a species level in order to avoid misidentification and to be aware of the classification using the coagulase test alone.(AU)

A mastite é uma inflamação da glândula mamária que afeta o gado leiteiro em todo o mundo, causando perdas econômicas. Staphylococcus coagulase-negativa (SCN) são a causa predominante desse tipo de infecção. Mostrou-se recentemente que Staphylococcus coagulase-positiva podem ser identificados erroneamente. Assim, o objetivo deste estudo foi caracterizar cepas de Staphylococcus spp. inicialmente classificados como Staphylococcus coagulase-negativa, isolados de búfalas com mastite subclínica. O leite de búfalas com mastite foi coletado, e nove cepas foram identificadas como SCN por testes fenotípicos. Metodologias moleculares identificaram as cepas como Staphylococcus chromogenes coagulase-negativa (5) Staphylococcus hyicus coagulase-positiva (2) e Staphylococcus aureus coagulase-positiva (2). Os resultados reforçam a necessidade de identificar as cepas em termos de espécie, a fim de se evitarem erros de identificação e estar atento à classificação utilizando o teste de coagulase sozinho.(AU)

SHORT-COMMUNICATION Evaluation of perfused bovine udder for gene expression studies in dairy cows.

Intramammary infections are one of the main causes of productivity loss in dairy cows. To better understand the immune system response and to avoid the use of live animals, we validated the use of isolated bovine udder as an ex situ model. Six mammary glands were collected from cows ready for culling. Three udders were perfused with Tyrode's solution and three were not-perfused. During six hours, we collected perfusate samples for biochemical analysis. We also collected alveolar and teat canal tissue to evaluate gene expression. The biochemical parameters indicated that the perfused udders remained viable for the entire period of the experiment. A real-time polymerase chain reaction showed an increase in 18S rRNA gene expression in the alveolar tissue at 3 and 4 h after perfusion. There was also an increase in the Ubiquitin gene in the teat canal from not-perfused udders at 1, 3, and 4 h after slaughter. In general, gene expression was stable during the experiment. Our results indicated that the isolated perfused bovine udder model is appropriate for genetic studies, opening a new perspective in animal experimentation methods.

Characterization of Staphylococcus spp. strains in milk from buffaloes with mastitis in Brazil: the need to identify to species level to avoid misidentification

ABSTRACT Mastitis is an inflammation of the mammary gland that affects dairy cattle worldwide causing economic losses. Coagulase-negative staphylococci (CNS) are the predominant cause of this type of infection. We have recently showed that coagulase-positive staphylococci could be misidentified. So, the aim of this study was to characterize the Staphylococcus spp. strains initially classified as coagulase-negative Staphylococci, isolated from buffalo with subclinical mastitis. Milk of buffaloes with mastitis in herds was collected and 9 strains were identified as CNS by phenotypic tests. Molecular methodologies latter identified the strains as coagulase-negative Staphylococcus chromogenes (5), coagulase-positive Staphylococcus hyicus (2) and coagulase-positive Staphylococcus aureus (2). Our results strongly support the need to identify the isolates to a species level in order to avoid misidentification and to be aware of the classification using the coagulase test alone.

RESUMO A mastite é uma inflamação da glândula mamária que afeta o gado leiteiro em todo o mundo, causando perdas econômicas. Staphylococcus coagulase-negativa (SCN) são a causa predominante desse tipo de infecção. Mostrou-se recentemente que Staphylococcus coagulase-positiva podem ser identificados erroneamente. Assim, o objetivo deste estudo foi caracterizar cepas de Staphylococcus spp. inicialmente classificados como Staphylococcus coagulase-negativa, isolados de búfalas com mastite subclínica. O leite de búfalas com mastite foi coletado, e nove cepas foram identificadas como SCN por testes fenotípicos. Metodologias moleculares identificaram as cepas como Staphylococcus chromogenes coagulase-negativa (5) Staphylococcus hyicus coagulase-positiva (2) e Staphylococcus aureus coagulase-positiva (2). Os resultados reforçam a necessidade de identificar as cepas em termos de espécie, a fim de se evitarem erros de identificação e estar atento à classificação utilizando o teste de coagulase sozinho.

Efeito da temperatura das amostras de leite na concentração de cálcio solúvel e de beta-caseína: interferência no teste de estabilidade frente ao etanol / Effect of milk sample temperature on the concentration of soluble calcium and beta-casein: interference with the ethanol stability test

O objetivo deste trabalho foi avaliar a variação do perfil proteico e do cálcio solúvel na coagulação do leite pelo etanol nas temperaturas de 4ºC, 10ºC, 15ºC e 20ºC. Amostras de leite de 61 animais foram avaliadas quanto à estabilidade ao etanol nas concentrações de 66 a 92 por cento (v/v) nas temperaturas de 4ºC, 10ºC, 15ºC e 20ºC. Três amostras, após 24 horas de armazenamento a 4ºC, foram ultracentrifugadas em quadruplicata (40.000 x g) a 4ºC e a 20ºC, respectivamente, por 60 minutos. Em seguida, o sobrenadante foi retirado e submetido à análise do cálcio solúvel pela técnica via úmida (digestão nitroperclórica) e leitura em espectrofotômetro de absorção atômica. O perfil proteico foi analisado pela técnica de eletroforese capilar empregando kit específico para determinação proteica. Os resultados mostraram uma correlação positiva entre o aumento da temperatura das amostras e a estabilidade do leite frente às diferentes concentrações de etanol. A porcentagem de cálcio solúvel no sobrenadante após ultracentrifugação foi maior nas amostras tratadas a 4ºC (P<0,05). As amostras ultracentrifugadas na temperatura de 4ºC apresentaram quantidades superiores de β-caseína no sobrenadante em comparação com as amostras tratadas a 20ºC. O abaixamento da temperatura favoreceu a migração da β-caseína e do cálcio coloidal para a fase solúvel do leite, o que possivelmente favoreceu o aumento da instabilidade das amostras no teste do etanol. Os resultados sugerem que a temperatura ideal para a realização de teste de estabilidade do leite frente ao etanol deveria ser de 21ºC.(AU)

The aim of this study was to evaluate the variation in protein profile and soluble calcium in milk coagulation by ethanol at 4ºC, 10ºC, 15ºC and 20ºC. Milk samples from 61 dairy cows were evaluated for stability of ethanol concentrations from 66 to 92 percent (v/v) at temperatures of 4°C, 10°C, 15°C and 20°C. Three samples were ultracentrifuged (40,000 x g) after 24 hours of storage at 4°C and 20°C, respectively, for 60 minutes. Their supernatants were removed and subjected to analyses of soluble calcium through nitro-perchloric digestion and atomic absorption spectrophotometry. The protein profiles were determined by capillary electrophoresis using a specific kit for protein determination. The results showed a positive correlation between the increase in temperature of the samples and the stability of milk against various concentrations of ethanol. The percentage of soluble calcium in the supernatant after centrifugation was higher in samples treated at 4°C (P<0.05). The samples ultracentrifuged at 4°C showed higher amounts of β-casein in the supernatant compared with samples stored at 20°C. The lowering of the temperature favored the migration of β-casein and colloidal calcium to the soluble phase of milk, which may also have favored the instability of milk in the ethanol test. According to the results, the milk sample temperature for the ethanol stability test should be 21ºC.(AU)

Efeito da temperatura das amostras de leite na concentração de cálcio solúvel e de beta-caseína: interferência no teste de estabilidade frente ao etanol / Effect of milk sample temperature on the concentration of soluble calcium and beta-casein: interference with the ethanol stability test

O objetivo deste trabalho foi avaliar a variação do perfil proteico e do cálcio solúvel na coagulação do leite pelo etanol nas temperaturas de 4ºC, 10ºC, 15ºC e 20ºC. Amostras de leite de 61 animais foram avaliadas quanto à estabilidade ao etanol nas concentrações de 66 a 92 por cento (v/v) nas temperaturas de 4ºC, 10ºC, 15ºC e 20ºC. Três amostras, após 24 horas de armazenamento a 4ºC, foram ultracentrifugadas em quadruplicata (40.000 x g) a 4ºC e a 20ºC, respectivamente, por 60 minutos. Em seguida, o sobrenadante foi retirado e submetido à análise do cálcio solúvel pela técnica via úmida (digestão nitroperclórica) e leitura em espectrofotômetro de absorção atômica. O perfil proteico foi analisado pela técnica de eletroforese capilar empregando kit específico para determinação proteica. Os resultados mostraram uma correlação positiva entre o aumento da temperatura das amostras e a estabilidade do leite frente às diferentes concentrações de etanol. A porcentagem de cálcio solúvel no sobrenadante após ultracentrifugação foi maior nas amostras tratadas a 4ºC (P<0,05). As amostras ultracentrifugadas na temperatura de 4ºC apresentaram quantidades superiores de β-caseína no sobrenadante em comparação com as amostras tratadas a 20ºC. O abaixamento da temperatura favoreceu a migração da β-caseína e do cálcio coloidal para a fase solúvel do leite, o que possivelmente favoreceu o aumento da instabilidade das amostras no teste do etanol. Os resultados sugerem que a temperatura ideal para a realização de teste de estabilidade do leite frente ao etanol deveria ser de 21ºC...

The aim of this study was to evaluate the variation in protein profile and soluble calcium in milk coagulation by ethanol at 4ºC, 10ºC, 15ºC and 20ºC. Milk samples from 61 dairy cows were evaluated for stability of ethanol concentrations from 66 to 92 percent (v/v) at temperatures of 4°C, 10°C, 15°C and 20°C. Three samples were ultracentrifuged (40,000 x g) after 24 hours of storage at 4°C and 20°C, respectively, for 60 minutes. Their supernatants were removed and subjected to analyses of soluble calcium through nitro-perchloric digestion and atomic absorption spectrophotometry. The protein profiles were determined by capillary electrophoresis using a specific kit for protein determination. The results showed a positive correlation between the increase in temperature of the samples and the stability of milk against various concentrations of ethanol. The percentage of soluble calcium in the supernatant after centrifugation was higher in samples treated at 4°C (P<0.05). The samples ultracentrifuged at 4°C showed higher amounts of β-casein in the supernatant compared with samples stored at 20°C. The lowering of the temperature favored the migration of β-casein and colloidal calcium to the soluble phase of milk, which may also have favored the instability of milk in the ethanol test. According to the results, the milk sample temperature for the ethanol stability test should be 21ºC...

Production of antilisterial bacteriocins by staphylococci isolated from bovine milk.

A collection of 111 staphylococcal isolates recovered from healthy cows in 41 dairy herds in Brazil was surveyed for the production of bacteriocins. The group included 94 coagulase-positive and 17 coagulase-negative strains of staphylococci. All cultures were grown in tryptic soy broth for 18h at 37°C, and cell-free supernatants were tested for antimicrobial activity against several target organisms by using the agar diffusion method. Filtrates of 57 staphylococci showed strong activity against Listeria monocytogenes Scott A, and 52 isolates also inhibited the growth of Stapylococcus aureus Newbould 305, a major causative agent of bovine mastitis in the United States. The plasmid profiles of staphylococci invariably included an 8-kb plasmid. Staphylococcal isolates were tested for the production of aureocins A70 and A53, 2 bacteriocins of coagulase-positive staphylococci known to be associated with 8-kb and 10.2-kb plasmids, respectively. The presence of the A70 or A53 bacteriocin gene was checked by PCR techniques using primers based on nucleotide sequences flanking the structural gene of each bacteriocin. Agarose gel analysis of amplified PCR products of plasmid templates from all 58 isolates showed only a 525-bp fragment corresponding to the structural gene of the bacteriocin aureocin A70. The results indicated that the apparently widespread association of A70-producing staphylococci with healthy cows in Brazil may be beneficial in controlling undesirable bacteria in dairy herds.

Detecção de Listeria monocytogenes pela técnica de PCR em leite contaminado artificialmente / Detection of Listeria monocytogenes by PCR in artificially contaminated milk samples

Avaliou-se a técnica de PCR como opção para reduzir o tempo de detecção de Listeria monocytogenes no leite. Para tanto, amostras de leite desnatado esterilizado e de leite cru integral - com baixa, média e alta contagem de microrganismos aeróbios mesófilos - foram inoculadas experimentalmente com diversas concentrações de L. monocytogenes. Os resultados da reação de PCR foram comparados com os da cultura da amostra empregando-se metodologia padronizada tradicional. Não se detectou L. monocytogenes pela reação de PCR quando esta foi realizada a partir do caldo de enriquecimento de Listeria (LEB) após 24 horas de incubação, nem no leite desnatado esterilizado, nem no leite cru integral. Após 48 horas de enriquecimento em LEB, a bactéria foi detectada por PCR nas amostras de leite desnatado esterilizado, com a sensibilidade de 1UFC/mL, mas não nas amostras de leite cru integral. Pela metodologia tradicional, a bactéria foi recuperada de todos os ensaios. Entretanto, nas amostras de leite cru com altas contagens de aeróbios mesófilos, a sensibilidade da metodologia tradicional foi reduzida (a partir de 7UFC/mL). Melhores resultados foram obtidos quando a reação de PCR foi feita utilizando-se DNA obtido diretamente da colônia suspeita em meio sólido (Oxford e Palcam). Foi possível substituir os testes fenotípicos de identificação de L. monocytogenes pela técnica de PCR reduzindo-se o tempo de identificação da bactéria de vários dias para algumas horas.(AU)

The polymerase chain reaction (PCR) was used to detect Listeria monocytogenes in inoculated milk samples after selective enrichment. Samples of sterile skim milk and raw whole milk (with low, intermediate, and high counts of aerobic mesophilic microorganisms) were inoculated with several concentrations of L. monocytogenes. The results of PCR assays were compared to the results of culturing the samples using a standardized traditional method for isolation of L. monocytogenes. The pathogen was detected by PCR in Listeria Enrichment Broth (LEB) after 48h-incubation (sensitivity of 1CFU/mL) but not after 24h-incubation from the samples prepared with sterile skim milk. L. monocytogenes was not detected by PCR in LEB after 24 and 48h-incubation from the samples prepared with raw whole milk. Using the traditional method, the pathogen was detected in all experiments. However, sensitivity decreased in raw whole milk with high counts of aerobic mesophilic microorganisms (up to 7CFU/mL). Best results were obtained when PCR was done to identify presumptive L. monocytogenes colonies directly from Palcam and Oxford media, after the enrichment step. This procedure allowed reducing to a few hours the period of several days usually needed to obtain the final identification of L. monocytogenes using phenotypic tests.(AU)

Detecção de Listeria monocytogenes pela técnica de PCR em leite contaminado artificialmente / Detection of Listeria monocytogenes by PCR in artificially contaminated milk samples

Avaliou-se a técnica de PCR como opção para reduzir o tempo de detecção de Listeria monocytogenes no leite. Para tanto, amostras de leite desnatado esterilizado e de leite cru integral - com baixa, média e alta contagem de microrganismos aeróbios mesófilos - foram inoculadas experimentalmente com diversas concentrações de L. monocytogenes. Os resultados da reação de PCR foram comparados com os da cultura da amostra empregando-se metodologia padronizada tradicional. Não se detectou L. monocytogenes pela reação de PCR quando esta foi realizada a partir do caldo de enriquecimento de Listeria (LEB) após 24 horas de incubação, nem no leite desnatado esterilizado, nem no leite cru integral. Após 48 horas de enriquecimento em LEB, a bactéria foi detectada por PCR nas amostras de leite desnatado esterilizado, com a sensibilidade de 1UFC/mL, mas não nas amostras de leite cru integral. Pela metodologia tradicional, a bactéria foi recuperada de todos os ensaios. Entretanto, nas amostras de leite cru com altas contagens de aeróbios mesófilos, a sensibilidade da metodologia tradicional foi reduzida (a partir de 7UFC/mL). Melhores resultados foram obtidos quando a reação de PCR foi feita utilizando-se DNA obtido diretamente da colônia suspeita em meio sólido (Oxford e Palcam). Foi possível substituir os testes fenotípicos de identificação de L. monocytogenes pela técnica de PCR reduzindo-se o tempo de identificação da bactéria de vários dias para algumas horas.

The polymerase chain reaction (PCR) was used to detect Listeria monocytogenes in inoculated milk samples after selective enrichment. Samples of sterile skim milk and raw whole milk (with low, intermediate, and high counts of aerobic mesophilic microorganisms) were inoculated with several concentrations of L. monocytogenes. The results of PCR assays were compared to the results of culturing the samples using a standardized traditional method for isolation of L. monocytogenes. The pathogen was detected by PCR in Listeria Enrichment Broth (LEB) after 48h-incubation (sensitivity of 1CFU/mL) but not after 24h-incubation from the samples prepared with sterile skim milk. L. monocytogenes was not detected by PCR in LEB after 24 and 48h-incubation from the samples prepared with raw whole milk. Using the traditional method, the pathogen was detected in all experiments. However, sensitivity decreased in raw whole milk with high counts of aerobic mesophilic microorganisms (up to 7CFU/mL). Best results were obtained when PCR was done to identify presumptive L. monocytogenes colonies directly from Palcam and Oxford media, after the enrichment step. This procedure allowed reducing to a few hours the period of several days usually needed to obtain the final identification of L. monocytogenes using phenotypic tests.

Variação da contagem de células somáticas em vacas leiteiras de acordo com patógenos da mastite / Somatic cell counts variation in dairy cows according to mastitis pathogens

Avaliou-se o efeito de patógenos da mastite sobre a contagem de células somáticas (CCS) em leite. Foram coletadas 3.987 amostras de leite de 2.657 animais oriundos de 24 rebanhos leiteiros localizados nos estados do Rio de Janeiro e Minas Gerais. As amostras de leite foram usadas para CCS e identificação de patógenos da mastite. Estatísticas descritivas, teste T para amostras independentes e modelo linear generalizado foram usados para análise dos dados. O modelo linear generalizado identificou os efeitos de rebanho, animal dentro de rebanho, ordem de parto, estação do ano e infecção intramamária causada por Streptococcus agalactiae e Streptococcus spp. que não S. agalactiae como significativos na variação da CCS. O efeito de animal dentro de rebanho foi maior que o efeito de rebanho. S. agalactiae foi o patógeno responsável pelo maior aumento da CCS em vacas e apresentou em média 1.520.000 células/mL. Foi observado efeito específico dos patógenos na variação da CCS.(AU)

The influence of mastitis pathogens on variation of milk somatic cell count (SCC) was evaluated. Three thousand nine hundred eighty-seven milk samples were colected from 2,657 dairy cows in 24 herds located in the states of Minas Gerais and Rio de Janeiro. The milk samples were used to SCC and identification of mastitis pathogens. Descriptive statistics, T test for independent samples, and generalized linear model were used to data analysis. The generalized linear model identified the effects of herd, animal within herd, parity, year season, intramammary infection, and infection caused by Streptococcus agalactiae and Streptococcus spp. except S. agalactiae as significant on SCC variation. The effect of animal within herd was higher than the effect of herd. S. agalactiae was the pathogen responsible for higher SCC increasing and presented the average of 1,520,000 cells/mL. The specific effect on SCC variation was observed in the study.(AU)

Variação da contagem de células somáticas em vacas leiteiras de acordo com patógenos da mastite / Somatic cell counts variation in dairy cows according to mastitis pathogens

Avaliou-se o efeito de patógenos da mastite sobre a contagem de células somáticas (CCS) em leite. Foram coletadas 3.987 amostras de leite de 2.657 animais oriundos de 24 rebanhos leiteiros localizados nos estados do Rio de Janeiro e Minas Gerais. As amostras de leite foram usadas para CCS e identificação de patógenos da mastite. Estatísticas descritivas, teste T para amostras independentes e modelo linear generalizado foram usados para análise dos dados. O modelo linear generalizado identificou os efeitos de rebanho, animal dentro de rebanho, ordem de parto, estação do ano e infecção intramamária causada por Streptococcus agalactiae e Streptococcus spp. que não S. agalactiae como significativos na variação da CCS. O efeito de animal dentro de rebanho foi maior que o efeito de rebanho. S. agalactiae foi o patógeno responsável pelo maior aumento da CCS em vacas e apresentou em média 1.520.000 células/mL. Foi observado efeito específico dos patógenos na variação da CCS.

The influence of mastitis pathogens on variation of milk somatic cell count (SCC) was evaluated. Three thousand nine hundred eighty-seven milk samples were colected from 2,657 dairy cows in 24 herds located in the states of Minas Gerais and Rio de Janeiro. The milk samples were used to SCC and identification of mastitis pathogens. Descriptive statistics, T test for independent samples, and generalized linear model were used to data analysis. The generalized linear model identified the effects of herd, animal within herd, parity, year season, intramammary infection, and infection caused by Streptococcus agalactiae and Streptococcus spp. except S. agalactiae as significant on SCC variation. The effect of animal within herd was higher than the effect of herd. S. agalactiae was the pathogen responsible for higher SCC increasing and presented the average of 1,520,000 cells/mL. The specific effect on SCC variation was observed in the study.

Detecção de Escherichia coli O157: H7 inoculada experimentalmente em amostras de leite cru por método convencional e PCR multiplex / Detection of E. coli O157: H7 experimentally inoculated in raw milk samples by conventional method and multiplex PCR

Padronizou-se um método de reação em cadeia da polimerase (PCR) multiplex para detecção de Escherichia coli O157:H7 e avaliou-se a eficiência da PCR e de um método de cultivo convencional em placas na detecção desse patógeno experimentalmente adicionado em leite estéril e em leite cru com baixa contagem bacteriana total (média de 4,01 x 10³ UFC/ml) e com alta contagem bacteriana (média de 2,10 x 10(6) UFC/ml). Foram padronizadas duas reações de PCR com o uso dos primers: "A" (RfbF; RfbR e FLICh7F/FLICh7R) e "B" (SLT-IF/SLTIR e SLT-IIF/SLT-IIR). A detecção de E. coli O157:H7 (1UFC/ml) a partir do leite estéril e do leite cru com baixa contaminação bacteriana foi possível quando se utilizou o método de contagem em placas e a PCR. A sensibilidade dos dois métodos foi menor quando se testou o leite cru com alta contaminação microbiana, sendo o método convencional mais sensível. Os resultados indicam que a presença de outros microrganismos, em alta quantidade no leite, dificulta a detecção de E. coli O157:H7 pelos métodos utilizados.(AU)

This experiment was carried out in order to evaluate the effect of the raw milk bacterial count on the efficiency of a multiplex polymerase chain reaction and a conventional plate count method for detection of Escherichia coli O157:H7. This pathogen was experimentally inoculated into sterile milk, raw milk with low bacterial count (count mean of 4.01 x 10³ cfu/ml) and, raw milk with high bacterial count (mean 2.10 x 10(6) cfu/ml). Two protocols of PCR were standardized using primers "A" (Rfbf and Rfbr and FLICh7F/FLICh7R) and "B" (SLT-IF/SLTIR and SLT-IIF/SLT-IIR). Both conventional plate count and PCR methods were able to detect the presence of E. coli O157:H7 in either sterile milk or raw milk with low bacterial count initially inoculated with 1cfu of E. coli O157:H7 per ml. The sensibility of both methods for high-contaminated raw milk samples was lower, being the conventional approach more sensitive. These results indicate that high bacterial count in raw milk can affect E. coli O157:H7 detection.(AU)

Detecção de Escherichia coli O157: H7 inoculada experimentalmente em amostras de leite cru por método convencional e PCR multiplex / Detection of E. coli O157: H7 experimentally inoculated in raw milk samples by conventional method and multiplex PCR

Padronizou-se um método de reação em cadeia da polimerase (PCR) multiplex para detecção de Escherichia coli O157:H7 e avaliou-se a eficiência da PCR e de um método de cultivo convencional em placas na detecção desse patógeno experimentalmente adicionado em leite estéril e em leite cru com baixa contagem bacteriana total (média de 4,01 x 10³ UFC/ml) e com alta contagem bacteriana (média de 2,10 x 10(6) UFC/ml). Foram padronizadas duas reações de PCR com o uso dos primers: "A" (RfbF; RfbR e FLICh7F/FLICh7R) e "B" (SLT-IF/SLTIR e SLT-IIF/SLT-IIR). A detecção de E. coli O157:H7 (1UFC/ml) a partir do leite estéril e do leite cru com baixa contaminação bacteriana foi possível quando se utilizou o método de contagem em placas e a PCR. A sensibilidade dos dois métodos foi menor quando se testou o leite cru com alta contaminação microbiana, sendo o método convencional mais sensível. Os resultados indicam que a presença de outros microrganismos, em alta quantidade no leite, dificulta a detecção de E. coli O157:H7 pelos métodos utilizados.

This experiment was carried out in order to evaluate the effect of the raw milk bacterial count on the efficiency of a multiplex polymerase chain reaction and a conventional plate count method for detection of Escherichia coli O157:H7. This pathogen was experimentally inoculated into sterile milk, raw milk with low bacterial count (count mean of 4.01 x 10³ cfu/ml) and, raw milk with high bacterial count (mean 2.10 x 10(6) cfu/ml). Two protocols of PCR were standardized using primers "A" (Rfbf and Rfbr and FLICh7F/FLICh7R) and "B" (SLT-IF/SLTIR and SLT-IIF/SLT-IIR). Both conventional plate count and PCR methods were able to detect the presence of E. coli O157:H7 in either sterile milk or raw milk with low bacterial count initially inoculated with 1cfu of E. coli O157:H7 per ml. The sensibility of both methods for high-contaminated raw milk samples was lower, being the conventional approach more sensitive. These results indicate that high bacterial count in raw milk can affect E. coli O157:H7 detection.

Contagem de células somáticas e isolamento de agentes causadores de mastite em búfalas (Bubalus bubalis) / Somatic cell count and mastitis causing pathogens isolation in water buffaloes (Bubalus bubalis)

The research was accomplished in eight dairy water buffalo herds, randomically choosen in Região do Alto São Francisco, State of Minas Gerais, Brazil. Information was collected from March to November, 2003 during 270 days of observation. In order to determine the somatic cell count (SCC) in presence or absence of microbial isolation, 1,393 samples were collected from 285 lactating females and microbiological exams and SCC were done. Samples obtained from udders without evidence of clinical or subclinical inflammation showed infection for a great variety of microbial mastitis pathogens. The low SCC did not necessarily indicate the absence of intramammary infection, suggesting that SCC patterns used for bovine cannot be appropriate in order to control mastitis in buffalo herds.(AU)

Contagem de células somáticas e isolamento de agentes causadores de mastite em búfalas (Bubalus bubalis) / Somatic cell count and mastitis causing pathogens isolation in water buffaloes (Bubalus bubalis)

The research was accomplished in eight dairy water buffalo herds, randomically choosen in Região do Alto São Francisco, State of Minas Gerais, Brazil. Information was collected from March to November, 2003 during 270 days of observation. In order to determine the somatic cell count (SCC) in presence or absence of microbial isolation, 1,393 samples were collected from 285 lactating females and microbiological exams and SCC were done. Samples obtained from udders without evidence of clinical or subclinical inflammation showed infection for a great variety of microbial mastitis pathogens. The low SCC did not necessarily indicate the absence of intramammary infection, suggesting that SCC patterns used for bovine cannot be appropriate in order to control mastitis in buffalo herds.

Qualidade microbiológica do leite refrigerado nas fazendas / Microbiological quality of refrigerated milk on farms

Avaliaram-se a qualidade microbiológica do leite obtido mecanicamente e refrigerado durante 48 horas, em 24 rebanhos, e a associacao entre a contaminacao microbiana e os procedimentos de higienizacao dos equipamentos de ordenha e armazenamento do leite. Os procedimentos de higiene foram avaliados in loco com auxilio de questionários. Foram realizadas a contagem padrao em placas, a contagem de coliformes totais e a pesquisa de Staphylococcus aureus e Streptococcus agalactiae. No leite de 14 rebanhos, foram pesquisadas Salmonella spp. e Listeria monocytogenes. As médias geométricas da contagem padrao foram <1,0×10(6) UFC/ml em 20 rebanhos, e <7,5×10(5) UFC/ml em 19. Onze rebanhos apresentaram contagem média de <1,0×10(5) UFC/ml. Contagens médias de coliformes >10u UFC/ml foram verificadas em sete rebanhos. S. aureus e S. agalactiae foram isolados em 22 e 12 dos 24 rebanhos, respectivamente, e nao foram encontradas Salmonella spp. e L. monocytogenes. O uso de detergentes alcalino e ácido, mais o de sanitizante foi associado (P<0,05) à contagem padrao <1,0×10(5), e o emprego de apenas um ou de nenhum produto foi associado a contagens >5×10(5) UFC/ml.(AU)

The effect of bulk tank and milking machine cleaning procedures (determined from a questionnaire) on bacterial contamination of 48-hour refrigerated milk was examined in 24 herds. Milk samples were analyzed for standard plate count (SPC) and for total coliform, Staphylococcus aureus and Streptococcus agalactiae contamination. Milk samples from 14 herds were cultured for Salmonella and Listeria monocytogenes. Geometrical means of SPC were <1.0×10(6) UFC/ml in 20 herds, <7.5×10(5) UFC/ml in 19 herds and <1.0×10(5) UFC/ml in 11 herds. Geometrical means >10u UFC/ml of total coliforms were observed in seven herds. S. aureus and S. agalactiae were found in 22 and 12 herds, respectively. Salmonella and L. monocytogenes were not found in any of the samples. The use of alkaline and acid detergents plus sanitizing was associated (P<0.05) with SPC <1.0×10(5), and the use of either alkoline or acid detergent or sanitizing or no chemical product was associated with SPC >5.0×10(5) UFC/ml.(AU)

Qualidade microbiológica do leite refrigerado nas fazendas / Microbiological quality of refrigerated milk on farms

Avaliaram-se a qualidade microbiológica do leite obtido mecanicamente e refrigerado durante 48 horas, em 24 rebanhos, e a associação entre a contaminação microbiana e os procedimentos de higienização dos equipamentos de ordenha e armazenamento do leite. Os procedimentos de higiene foram avaliados in loco com auxilio de questionários. Foram realizadas a contagem padrão em placas, a contagem de coliformes totais e a pesquisa de Staphylococcus aureus e Streptococcus agalactiae. No leite de 14 rebanhos, foram pesquisadas Salmonella spp. e Listeria monocytogenes. As médias geométricas da contagem padrão foram <1,0×10(6) UFC/ml em 20 rebanhos, e <7,5×10(5) UFC/ml em 19. Onze rebanhos apresentaram contagem média de <1,0×10(5) UFC/ml. Contagens médias de coliformes >10³ UFC/ml foram verificadas em sete rebanhos. S. aureus e S. agalactiae foram isolados em 22 e 12 dos 24 rebanhos, respectivamente, e não foram encontradas Salmonella spp. e L. monocytogenes. O uso de detergentes alcalino e ácido, mais o de sanitizante foi associado (P<0,05) à contagem padrão <1,0×10(5), e o emprego de apenas um ou de nenhum produto foi associado a contagens >5×10(5) UFC/ml.

The effect of bulk tank and milking machine cleaning procedures (determined from a questionnaire) on bacterial contamination of 48-hour refrigerated milk was examined in 24 herds. Milk samples were analyzed for standard plate count (SPC) and for total coliform, Staphylococcus aureus and Streptococcus agalactiae contamination. Milk samples from 14 herds were cultured for Salmonella and Listeria monocytogenes. Geometrical means of SPC were <1.0×10(6) UFC/ml in 20 herds, <7.5×10(5) UFC/ml in 19 herds and <1.0×10(5) UFC/ml in 11 herds. Geometrical means >10³ UFC/ml of total coliforms were observed in seven herds. S. aureus and S. agalactiae were found in 22 and 12 herds, respectively. Salmonella and L. monocytogenes were not found in any of the samples. The use of alkaline and acid detergents plus sanitizing was associated (P<0.05) with SPC <1.0×10(5), and the use of either alkoline or acid detergent or sanitizing or no chemical product was associated with SPC >5.0×10(5) UFC/ml.

Efeito da temperatura e do tempo de armazenamento sobre a contagem de células somáticas no leite / Effects of temperature and storage on somatic cell counts in milk

Avaliou-se o efeito da temperatura e do tempo de armazenamento sobre a contagem de células somáticas(CCS). Amostras de leite de 21 vacas, coletadas e armazenadas às temperaturas de 5, 27, 32 e 36ºC e analisadas no 1º, 3º, 5º e 7º dia após coleta, foram classificadas em três grupos (células/ml): baixa (236.000±164.000), média (624.000±356.000) e alta CCS (1.320.000±945.000). O delineamento experimental foi o de parcelas subdivididas. As médias da CCS foram iguais (P>0,05) para amostras mantidas à temperatura de 5ºC e analisadas entre o primeiro e o sétimo dias após a coleta e para aquelas mantidas às temperaturas 5, 27, 32 e 36ºC e analisadas no primeiro dia. Médias diferentes (P<0,05) da CCS foram observadas para amostras mantidas a 27, 32 e 36°C a partir do 5°, 5° e 3° dias, respectivamente. Foram observados decréscimos de 57,6%, 58,5% e 27,9% nos valores iniciais da CCS nas amostras classificadas como baixa, média e alta, respectivamente. Os resultados mostram a necessidade de se encaminhar as amostras de leite para CCS sob refrigeração e de ser feita análise até sete dias após a coleta.(AU)

Effects of temperature and storage duration on somatic cell counts (SCC) of milk samples were studied in a split plot design with seven replicates. Samples from 21 cows were maintained at 5, 27, 32 or 36ºC (plots) and analyzed after 1, 3, 5 and 7 days of storage (split plots). Based upon an initial analysis, samples were classified into three groups: low (236,000±164,000), medium (624,000±356,000) and high (1,320,000±945,000) SCC/ml. No significant differences in SCC (P>0.05) were observed among storage temperatures for milk samples tested after one day of storage. For milk samples stored at 5°C, SCC averages did not significantly change (P>0.05) until the seventh day after collection. On days 5, 5 and 3, respectively, average SCC decreased for milk samples stored at 27, 32 and 36°C. Reductions of 57.6% (from 236,000 to 100,000), 58.5% (from 624,000 to 259,000) and 27.5% (from 1,320,000 to 952,000) from initial numbers of somatic cells were observed for samples classified as low, medium and high, respectively. Milk samples must be kept under refrigeration until analysis, and SCC must be measured within 7 days of sample collection.(AU)

Efeito da temperatura e do tempo de armazenamento sobre a contagem de células somáticas no leite / Effects of temperature and storage on somatic cell counts in milk

Avaliou-se o efeito da temperatura e do tempo de armazenamento sobre a contagem de células somáticas(CCS). Amostras de leite de 21 vacas, coletadas e armazenadas às temperaturas de 5, 27, 32 e 36°e e analisadas no 1°, 3°, 5°e 7° dia após coleta, foram classificadas em três grupos (células/ml): baixa (236.000 + ou - H64.000), média (624.000+ ou - 356.000) e alta CCS (1.320.000+ ou - 945.000). O delineamento experimental foi o de parcelas subdivididas. As médias da CCS foram iguais (P>0,05) para amostras mantidas à temperatura de 5°C e analisadas entre o primeiro e o sétimo dias após a coleta e para aquelas mantidas às temperaturas 5, 27, 32 e 36°e e analisadas no primeiro dia. Médias diferentes (P<0,05) da CCS foram observadas para amostras mantidas a 27, 32 e 36°e a partir do 5°, 5° e 3° dias, respectivamente. Foram observados decréscimos de 57,6%, 58,5% e 27,9% nos valores iniciais da CCS nas amostras classificadas como baixa, média e alta, respectivamente. Os resultados mostram a necessidade de se encaminhar as amostras de leite para CCS sob refrigeração e de ser feita análise até sete dias após a coleta.

Fatores de risco associados à alta contagem de células somáticas do leite do tanque em rebanhos leiteiros da Zona da Mata de Minas Gerais / Risk factors associated with high bulk milk somatic cell count in dairy herds from Zona da Mata of Minas Gerais, Brazil

Características do rebanho e práticas de manejo associadas à contagem de células somáticas do leite do tanque (CCSLT) foram estudadas em 175 rebanhos envolvidos em programas de acompanhamento entre junho de 2000 e dezembro de 2001. Os dados foram obtidos por meio de aplicação de questionários. Os rebanhos foram classificados em dois grupos de acordo com a média geométrica de seis CCSL T mensais, consecutivas, tendo como referência o valor de 500.000 células/ml. Os métodos estatísticos utilizados foram a análise exploratória dos dados e os modelos logísticos de regressão. Procedimentos relacionados ao controle e à prevenção de mastite foram adotados por pequeno número de rebanhos. O tipo de ordenha (manual, mecânica canalizada e balde-ao-pé), a idade média dos rebanhos, o local de ordenha e a realização de exames dos primeiros jatos de leite não foram associados à alta CCSLT. Os fatores associados à alta CCSLT foram a não adoção de linha de ordenha, a alimentação durante a ordenha e a ausência de anti-sepsia dos tetos após a ordenha.