RESUMEN
Hedgehog (Hh) proteins function in cell/cell signaling processes linked to human embryo development and the progression of several types of cancer. Here, we describe an optical assay of hedgehog cholesterolysis, a unique autoprocessing event critical for Hh function. The assay uses a recombinant Förster resonance energy transfer (FRET)-active Hh precursor whose cholesterolysis can be monitored continuously in multi-well plates (dynamic range=4, Z'=0.7), offering advantages in throughput over conventional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) assays. Application of the optical assay in a pilot small molecule screen produced a novel cholesterolysis inhibitor (apparent IC50=5×10(-6)M) that appears to inactivate hedgehog covalently by a substitution nucleophilic aromatic (SNAr) mechanism.
Asunto(s)
Antineoplásicos/farmacología , Colesterol/metabolismo , Proteínas de Drosophila/antagonistas & inhibidores , Proteínas Hedgehog/antagonistas & inhibidores , Ensayos Analíticos de Alto Rendimiento , Procesamiento Proteico-Postraduccional/efectos de los fármacos , Secuencias de Aminoácidos , Animales , Secuencia Conservada , Proteínas de Drosophila/química , Proteínas de Drosophila/genética , Proteínas de Drosophila/metabolismo , Drosophila melanogaster/metabolismo , Transferencia Resonante de Energía de Fluorescencia , Proteínas Hedgehog/química , Proteínas Hedgehog/genética , Proteínas Hedgehog/metabolismo , Cinética , Proteínas Luminiscentes/química , Proteínas Luminiscentes/genética , Proteínas Luminiscentes/metabolismo , Nitrobenzoatos/farmacología , Fragmentos de Péptidos/antagonistas & inhibidores , Fragmentos de Péptidos/química , Fragmentos de Péptidos/genética , Fragmentos de Péptidos/metabolismo , Proyectos Piloto , Mutación Puntual , Dominios y Motivos de Interacción de Proteínas , Precursores de Proteínas/antagonistas & inhibidores , Precursores de Proteínas/química , Precursores de Proteínas/genética , Precursores de Proteínas/metabolismo , Proteolisis/efectos de los fármacos , Proteínas Recombinantes de Fusión/química , Proteínas Recombinantes de Fusión/metabolismo , Bibliotecas de Moléculas Pequeñas , Tetrazoles/farmacologíaRESUMEN
Hedgehog proteins, signaling molecules implicated in human embryo development and cancer, can be inhibited at the stage of autoprocessing by the trivalent arsenical phenyl arsine oxide (PhAs(III) ). The interaction (apparent Ki , 4 × 10(-7) M) is characterized by an optical binding assay and by NMR spectroscopy. PhAs(III) appears to be the first validated inhibitor of hedgehog autoprocessing, which is unique to hedgehog proteins and essential for biological activity.
Asunto(s)
Arsenicales/química , Colesterol/química , Proteínas Hedgehog/antagonistas & inhibidores , Precursores de Proteínas/antagonistas & inhibidores , Proteínas Recombinantes de Fusión/química , Animales , Dominio Catalítico , Relación Dosis-Respuesta a Droga , Drosophila melanogaster/química , Drosophila melanogaster/metabolismo , Expresión Génica , Proteínas Hedgehog/química , Proteínas Hedgehog/genética , Proteínas Hedgehog/metabolismo , Humanos , Hidrólisis , Cinética , Modelos Moleculares , Unión Proteica , Precursores de Proteínas/química , Precursores de Proteínas/genética , Precursores de Proteínas/metabolismo , Proteínas Recombinantes de Fusión/genética , Proteínas Recombinantes de Fusión/metabolismoRESUMEN
A series of tolyl 2-azido-2-deoxy-thio-glucoside donors with different combinations of protecting groups were prepared. These donors were used in glycosylation reactions to test the correlations between the stereoselectivity and the pattern of the protecting groups. Acetyl groups showed a position dependent stereo-directing effect. A remote participating mechanism is proposed to explain the observed results.