TOP1 modulation during melanoma progression and in adaptative resistance to BRAF and MEK inhibitors.

In melanomas, therapy resistance can arise due to a combination of genetic, epigenetic and phenotypic mechanisms. Due to its crucial role in DNA supercoil relaxation, TOP1 is often considered an essential chemotherapeutic target in cancer. However, how TOP1 expression and activity might differ in therapy sensitive versus resistant cell types is unknown. Here we show that TOP1 expression is increased in metastatic melanoma and correlates with an invasive gene expression signature. More specifically, TOP1 expression is highest in cells with the lowest expression of MITF, a key regulator of melanoma biology. Notably, TOP1 and DNA Single-Strand Break Repair genes are downregulated in BRAFi- and BRAFi/MEKi-resistant cells and TOP1 inhibition decreases invasion markers only in BRAFi/MEKi-resistant cells. Thus, we show three different phenotypes related to TOP1 levels: i) non-malignant cells with low TOP1 levels; ii) metastatic cells with high TOP1 levels and high invasiveness; and iii) BRAFi- and BRAFi/MEKi-resistant cells with low TOP1 levels and high invasiveness. Together, these results highlight the potential role of TOP1 in melanoma progression and resistance.

Indolamina 2, 3-dioxigenase (IDO) em melanoma: regulação frente ao inibidor de BRAF e sua expressão na progressão da doença / Indoleamine 2, 3-dioxygenase (IDO) in melanoma: regulation against BRAF inhibitor and its expression in disease progression

Os inibidores de BRAF (iBRAFs) e de MEK (iMEK), inauguraram uma nova classe de medicamentos, a terapia direcionada, no combate ao melanoma metastático. Entretanto, os pacientes adquirem resistência ao tratamento em poucos meses. Além disso, a imunoterapia vem ganhando espaço no tratamento do câncer, incluindo o melanoma, porém, com alguns aspectos inexplorados. Dentro deste tema, a enzima IDO vem despertando um grande interesse pela participação nos mecanismos de imunotolerância, imunoescape e progressão tumoral. A IDO é responsável pelo consumo e depleção do triptofano, produzindo a quinurenina. Ela está presente em diversos tipos celulares, incluindo células do sistema imune e células tumorais. Este trabalho objetivou avaliar a expressão de IDO durante a progressão da doença - desde do nevo até o melanoma metastático e também avaliar a regulação de IDO induzido por IFN-γ após tratamento com iBRAF em linhagens parentais e resistentes ao iBRAF, buscando-se os mecanismos moleculares. Por fim, objetivou-se entender os efeitos do 1-metil-triptofano (1-MT), um inibidor de IDO, tanto na sua capacidade de inibir a atividade de IDO quanto na sua influência na capacidade clonogênica. O estudo de bioinformática sobre o repositório público GSE12391 mostrou que o nível de expressão gênica de IDO foi superior nos estágios mais avançado da doença. Além disso, todas amostras de melanoma primário de pacientes apresentaram a imunomarcação de IDO, enquanto que nenhuma amostra de nevo apresentou tal marcação. Adicionalmente, a ocorrência de IDO se deu nos infiltrados linfoides, em células mononucleares do sistema imune. Duas análises de bioinformática de expressão gênica demonstraram que a IDO estava expressa positivamente na fase de resistência ao iBRAF. Ademais, os resultados de expressão proteica mostraram que a inibição de via MAPK (tanto por iBRAF quanto por iMEK) conseguiu modular a expressão de IDO, sendo que a maioria das linhagens apresentou uma diminuição de IDO. A atividade de IDO, medida através da produção de quinurenina, por HPLC se mostrou em consonância com os resultados de expressão proteica, exceto pela linhagem WM164 que não apresentou atividade enzimática, embora a proteína estivesse presente. Por fim, o 1-MT conseguiu inibir de maneira eficiente a enzima IDO, bloqueando a produção de quinurenina. Além de que, o 1-MT reduziu a capacidade clonogênica de maneira dose-dependente. Portanto, conclui-se que a expressão de IDO é crescente conforme a progressão do melanoma, que a inibição da via MAPK regulou a expressão de IDO e que o 1-MT reduz a capacidade clonogênica, além da sua função primária de inibir IDO

BRAF and MEK inhibitors (BRAFi and MEKi) has launched a new class of medication, the target therapy, to combat metastatic melanoma. Nevertheless, patients acquired resistance to the treatment in few months. Additionally, immunotherapy has been gaining space in cancer treatment, including melanoma, but some aspects need to be explored. Inside this theme, IDO enzyme has called the attention due to its participation in the mechanisms of immune tolerance, scape and tumor progression. IDO is responsible for tryptophan consume e depletion, producing kynurenine. It is present in different cells, including cells from immune system and tumor cells. This work purposed evaluate IDO expression during disease progression - since nevus until metastatic melanoma and also, evaluate IFN-γ-induced IDO regulation after BRAFi treatment in parental and resistant melanoma cell lines, seeking the molecular mechanisms. Lastly, it was evaluated the effects of 1-methyltryptopahn (1-MT), an IDO inhibitor, by its ability to inhibit IDO and also by its influency on the clonogenic capability. Bioinformatic study performed on GSE12391 showed that gene expression level of IDO was superior in the most advanced stages of the disease. Additionally, all sample of patient's primary melanoma presented IDO immunostaining, whereas, no nevus samples presented such staining. Besides, IDO occurrence was in the lymphoid infiltrates, in mononuclear cells from immune system. Two bioinformatic analysis of gene expression demonstrated that IDO was differentially overexpressed during BRAFi resistance stage. Moreover, protein expression results presented that MAPK pathway inhibition (both by BRAFi and by MEKy) was able to modulate IDO expression, and most of the cell lines presented an IDO downregulation. IDO activity, measured through kynurenine production, by HPLC was consonant with protein expression results, except by WM164 cell line, which did not present enzymatic activity, albeit the protein was present. By the end, 1-MT could inhibit efficiently IDO enzyme, blocking kynurenine production. Furthermore, 1-MT reduced clonogenic capability in a dosedependent manner. Therefore, it was concluded that IDO expression increases along with melanoma progression, MAPK pathway inhibition regulated IDO expression and 1-MT reduced clonogenic capability, besides its primary function of IDO inhibitor