ABSTRACT
O objetivo deste trabalho foi comparar a eficiência da solubilização de quatro detergentes comercialmente disponíveis, ASB 14, SB 3-10, CHAPS e Triton X100, na extração de proteínas de membrana da bactéria Xylella fastidiosa para estudos proteômicos. Estas proteínas foram solubilizadas em duas etapas em tampões diferenciados pelos detergentes e submetidas à eletroforese bidimensional (2-DE) em uma faixa de pH não linear de 3-10. Os detergentes ASB 14 e SB 3-10 foram os mais efecientes, revelando 221 e 157 proteínas, respectivamente, enquanto que o CHAPS e o Triton X100 resultaram somente 72 e 43 proteínas, respectivamente. A identificação das proteínas foi feita por 'peptide mass fingerprinting' em espectrometria de massa MALDI-TOF, através de peptídeos obtidos por digestão com tripsina in gel. Os 18 spots de proteínas do gel com tratamento com ASB 14 mostrou que 83% eram proteínas de membrana. Este estudo concluiu que o detergente ASB-14 foi o mais eficiente na solubilização de proteínas de membrana de Xylella fastidiosa.
ABSTRACT
The chromosomal ends of Leishmania (Leishmania) amazonensis contain conserved 5'-TTAGGG-3' telomeric repeats. Protein complexes that associate in vitro with these DNA sequences, Leishmania amazonensis G-strand telomeric protein (LaGT1-3), were identified and characterized by electrophoretic mobility shift assays and UV cross-linking using protein fractions purified from S100 and nuclear extracts. The three complexes did not form (a) with double-stranded DNA and the C-rich telomeric strand, (b) in competition assays using specific telomeric DNA oligonucleotides, or (c) after pretreatment with proteinase K. LaGT1 was the most specific and did not bind a Tetrahymena telomeric sequence. All three LaGTs associated with an RNA sequence cognate to the telomeric G-rich strand and a complex similar to LaGT1 is formed with a double-stranded DNA bearing a 3' G-overhang tail. The protein components of LaGT2 and LaGT3 were purified by affinity chromatography and identified, after renaturation, as approximately 35 and approximately 52 kDa bands, respectively. The Subject(s)
Leishmania/genetics
, Protozoan Proteins/metabolism
, Repetitive Sequences, Nucleic Acid
, Telomere-Binding Proteins/metabolism
, Telomere/genetics
, Animals
, Base Composition
, Base Sequence
, Cell Fractionation
, DNA, Protozoan/genetics
, DNA, Protozoan/isolation & purification
, DNA, Protozoan/metabolism
, Humans
, Leishmania/physiology
, Macromolecular Substances
, Mass Spectrometry
, Peptide Mapping
, Protozoan Proteins/isolation & purification
, Salts/chemistry
, Telomere-Binding Proteins/isolation & purification