Diagnóstico genético de fibrosis quística mediante la técnica de desnaturalización de ADN a alta resolución (HRM) / Genetic diagnosis of cystic fibrosis by high resolution melting of DNA (HRM)

La fibrosis quística es la enfermedad grave de herencia autosómica recesiva más frecuente en la raza caucásica, con una incidencia estimada entre 1/2.000 y 1/6.000 nacidos vivos y causada por mutaciones en el gen CFTR. La casi totalidad de los pacientes desarrollan una enfermedad pulmonar crónica y progresiva, que es la causa más frecuente de la morbimortalidad. En el 85% de los casos existe disfunción pancreática (exocrina o endocrina). El diagnóstico de la fibrosis quística se basa esencialmente en la historia clínica, aunque el diagnóstico etiológico es el diagnóstico molecular, con la identificación de las mutaciones en el gen CFTR. Para ello, existen técnicas de rastreo de mutaciones que identifican patrones anormales en la secuencia que necesitan ser confirmadas por secuenciación del ADN. Actualmente se acepta que el HRM es la técnica de rastreo más sensible en la búsqueda de variantes en la secuencia de ADN. Alternativamente, existen baterías diagnósticas actualmente disponibles comercialmente, que identifican las mutaciones más frecuentes en fibrosis quística con una sensibilidad superior al 75%. En este trabajo hemos hecho un análisis del gen CFTR en pacientes con fibrosis quística mediante la técnica de rastreo de mutaciones basada en la desnaturalización a alta resolución del ADN (High Resolution Melting [HRM]). En paralelo, en los mismos pacientes, hemos hecho un estudio comparativo de la sensibilidad del HRM con dos test comerciales y de estos dos test entre sí. Uno de los test, Devyser, incluye una batería complementaria para la identificación de mutaciones específicas de la población española. Los resultados de este trabajo indican que el HRM tiene una sensibilidad cercana al 100% en la detección de mutaciones y polimorfismos en el gen CFTR. Además la técnica de HRM es también más sensible que los test comerciales en el diagnóstico molecular de pacientes de fibrosis quística (AU)

Cystic fibrosis is the severe disease of autosomal recessive inheritance most common in caucasians, with an estimated incidence between 1/2,000 and 1/6,000 live births. This disease is caused by mutations in the CFTR gene. Almost all patients develop a chronic, progressive lung disease, which is the most common cause of morbidity and mortality. In 85% of cases there is also pancreatic dysfunction (exocrine and endocrine). The diagnosis of cystic fibrosis is essentially based on clinical history, although the etiologic diagnosis is the diagnosis at molecular level, with the identification of mutations in the CFTR gene. For this purpose, there are screening techniques that identify abnormal patterns that need to be confirmed by DNA sequencing. It is now accepted that the HRM is the most sensitive screening technique in the search for variants in the DNA sequence. Alternatively, there are diagnostic batteries currently available commercially, which identify the most common cystic fibrosis mutations with sensitivity greater than 75%. In this work we have done an analysis of the CFTR gene in cystic fibrosis patients by the screening technique based on denatured DNA at high resolution (High Resolution Melting [HRM]). In parallel, in the same patients, we have made a comparative study of the sensitivity of the HRM with two commercial test. One of the test, Devyser includes an additional battery for identification of specific mutations in the Spanish population. Results obtained indicated that HRM has a sensibility closed to 100% for the detection of mutations and polymorphisms in CFTR gene. Furthermore, HRM presented higher sensitivity than the commercial tests for molecular diagnosis of cystic fibrosis patients (AU)

Fibrosis quística: detección bioquímica y diagnóstico molecular / Cystic fibrosis: biochemical detection and molecular diagnosis

La fibrosis quística es la enfermedad de herencia autosómica recesiva grave más frecuente en población caucásica. Su prevalencia en los países de Europa occidental es de un caso de cada 2.000 a 6.000 recién nacidos vivos. Los pacientes desarrollan una enfermedad pulmonar crónica y progresiva, que es la causa más frecuente de la morbimortalidad. En el 85% de los casos existe, además, insuficiencia pancreática. Son frecuentes las alteraciones hepatobiliares y genitourinarias, la azoospermia, aunque la enfermedad pulmonar y la insuficiencia pancreática son las que determinan la gravedad del proceso. Es una enfermedad genética causada por defectos en el gen CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), en el que se han descrito hasta la fecha más de 1.900 mutaciones. El diagnóstico de la enfermedad es fundamentalmente clínico y la confirmación se realiza mediante la detección de niveles altos de cloro en sudor y la identificación de mutaciones en el gen CFTR (AU)

Cystic fibrosis is the most severe common autosomal recessive disease in caucasian population. Its prevalence in countries of Western Europe is one case in 2.000-6.000 live births. Patients develop a chronic, progressive lung disease, which is the most common cause of morbidity and mortality. In 85% of cases there is also pancreatic insufficiency. Hepatobiliary and genitourinary disorders and azoospermia are frequent, although lung symptoms and pancreatic insufficiency determine the severity of the disease. It is a genetic disease caused by defects in the CFTR gene (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator). To date more than 1900 mutations have been reported. Diagnosis of the disease is essentially clinical and confirmation is made by the detection of high levels of sweat chloride and the identification of mutations in the CFTR gen (AU)

Determinación de ácido etilendiaminotetraacético por espectrometría de masas en tándem en muestras de sangre impregnadas en papel. Utilidad en la medida de tirotropina para cribado neonatal de hipotiroidismo congénito / Determination of EDTA by tandem mass spectrometry in dried blood samples. Usefulness in TSH determinations for Congenital Hypothyroidism in newborn screening

Introducción. Los programas para cribado neonatal utilizan muestras de sangre impregnada en papel, en ellas se determinan los marcadores de las patologías incluidas. La presencia de anticoagulantes en las muestras puede producir interferencias en los métodos de medida y se recomienda su no utilización. No es posible reconocer las muestras recogidas con anticoagulante. Material y métodos. Se desarrolló y optimizó un procedimiento por espectrometría de masas en tándem con electrospray (ESI-MS/MS) para la determinación de EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) en las muestras de sangre en papel y se valoró su inclusión en el perfil de aminoácidos y acilcarnitinas utilizado para la detección precoz neonatal de enfermedades metabólicas. Se estudió su influencia sobre las medidas de tirotropina (TSH), realizadas para el cribado neonatal de hipotiroidismo congénito. Resultados. Se optimizaron los parámetros que permiten la medida de EDTA en el eluato de sangre. Se ha determinado TSH en sangre en papel, suero y plasma de un grupo de 110 muestras y EDTA en otro grupo de 2.300 muestras provenientes del programa de cribado neonatal detectando su presencia en un 0,74% de las mismas. Conclusiones. El método desarrollado es válido para la determinación de este anticoagulante y se puede incluir en el perfil de aminoácidos y acilcarnitinas por MS/MS para detectar aquellas muestras que se extrajeron inadecuadamente. Se ha confirmado la influencia negativa del EDTA en la determinación de TSH mediante un fluoroinmunoensayo (AutoDELFIA(R)). Esto podría provocar un falso negativo en el cribado neonatal de hipotiroidismo congénito (AU)

Introduction. Newborn screening programs use blood impregnated paper to analyze disease markers. The presence of EDTA in samples may interfere in the analytical methods used to measure these markers. For this reason, it is recommended not use anticoagulants in these samples. Moreover, it is not possible to recognize samples that have been collected into EDTA. Material and Methods. We developed and optimized an electrospray tandem mass spectrometry (ES-MS/MS) method to determine EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) in dried blood spots (DBS) on paper. We also included the method in the amino acids and acylcarnitines profile used for metabolic diseases neonatal screening. We also studied the EDTA influence on thyrotropin (TSH) neonatal screening analysis. Results. Optimized parameters for EDTA analysis in the blood eluate were found. TSH analysis was performed on DBS, serum and plasma samples from 110 patients. EDTA analysis on 2000 neonatal screening samples detected 0.74% of cases with EDTA contamination. Conclusions. The negative influence of EDTA in the determination of TSH by fluoroimmunoassay (AutoDELFIA(R)) has been confirmed. This could cause a false negative in neonatal screening for congenital hypothyroidism. The developed method is valid for the determination of this blood anticoagulant and can be included in the profile of amino acids and acylcarnitines by MS / MS to detect those samples that were taken improperly (AU)