Field diagnosis and genotyping of chikungunya virus using a dried reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay and MinION sequencing.

Detection and sequencing of chikungunya virus (CHIKV) genome was performed using a combination of a modified reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) method and a MinION sequencer. We developed the protocol for drying all the reagents for the RT-LAMP in a single reaction tube. Using this system, the CHIKV genome was effectively amplified under isothermal conditions, and used as a template for MinION sequencing with a laptop computer. Our in-house RT-LAMP method and MinION sequencing system were also validated with RNAs and serum samples from recent outbreaks of CHIKV patients in Brazil. The obtained sequence data confirmed the CHIKV outbreaks and identified the genotype. In summary, our established inexpensive on-site genome detection and sequencing system is applicable for both diagnosis of CHIKV infected patients and genotyping of the CHIKV virus in future outbreak in remote areas.

Molecular epidemiology of dengue virus serotypes 2 and 3 in Paraguay during 2001-2006: the association of viral clade introductions with shifting serotype dominance.

To determine the genetic variability of dengue viruses (DENVs) in Paraguay, the complete envelope gene was sequenced for 4 DENV-2 and 22 DENV-3 strains isolated from 2001 to 2006. The sequence data were used in Bayesian phylogenetic analyses, which revealed that Paraguayan DENV-2 strains fell into two distinct clades within the American/Asian genotype, thus suggesting that the introduction of a new DENV-2 clade was likely associated with the shift of dominant serotype from DENV-3 to DENV-2 in 2005 and might have caused an outbreak of DENV-2. This study also indicated that DENV-3 strains fell into genotype III, of which, several 2006 isolates varied from the remaining isolates in their tree locations. The introduction of this new clade was likely associated with the shift of dominant serotype from DENV-2 to DENV-3 in 2006 and might have caused an epidemic of DENV-3. More data are needed to test this hypothesis.

Nucleotide sequence and phylogenetic analyses of dengue type 2 virus isolated in the Dominican Republic.

Dengue virus infection has been recognized as an important public health problem in the Dominican Republic in the last decade. Complete genomic sequences of three strains of dengue type 2 (DEN-2) virus, DR23/01 and DR31/01 isolated from dengue fever (DF) patients, and DR59/01 isolated from a dengue hemorrhagic fever (DHF) patient, all with primary infection, in the Dominican Republic in 2001, have been established. This achievement constitutes the first genomic characterization of DEN-2 strains from the Dominican Republic. No amino acid differences were observed between the strains isolated from DHF and DF patients. They exhibited extensive homology with the strain from La Martinique, French West Indies. Although phylogenetic analysis was suggestive of their Southeast Asiatic origin, Dominican Republic strains and other Caribbean strains from La Martinique and Jamaica showed 26 amino acid changes that differed from both the Southeast Asia and native American genotypes.

Estudios preliminares sobre el diagnóstico de leishmaniasis cutánea utilizando muestras de biopsias de piel por reacción en cadena de polimerasa

Se estudiaron métodos de diagnóstico de leishmaniasis cutánea por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando parásitos vultivados y muestras de biopsias de piel del Ecuador. Se prepararon template ADNs por ebullición por 10 minutos en soluciones Chelex al 5 por ciento. Los parásitos Leishmania fueron detectados por PCR, utilizando primers designados desdel el minicírculo (13A y 13B)y gen mini-exon (S-1629 y S-1630. Los primers primero mencionados amplificaron productos no específicos en ADN humano, y la sensibilidad de la reacción fue baja. Los últimos nunca amplificaron productos específicos aún en templete humano y posibilitaron la identificación a nivel de subgénero. Cuando se aumentó la sensibilidad...

Similaridad karyotipo de aislamientos de Leishmania de pacientes, flebotominos, y un perro doméstico, identificando la cepa L mexicana como el agente causal de la leishmaniasis cutánea en los Andes ecuatorianos

Los karyotipos DNA de Leishmania, aislados en 3 comunidades diferentes de los Andes ecuatorianos fueron examinados por electroforesis en gel agarosa de campo pulsado. La similaridad en el karyotipo fue detectada en 12 aislamientos; 4 aislamientos humanos y uno canino, aislados en Paute, 4 aislamientos y 1 de flebotomino aislados en Huigra, y 2 aislamientos de flebotominos en Alausí. Las distancias horizontales entre Paute y Alausí, y entre Alausí y Huigra, son de alrededor de 80 km y 20 km respectivamente. El patrón de banda de el DNA cromosómico de estos aislamientos, se caracterizó por una cadena cromosómica ordenada, especialmente por la presencia de 4 cromosomas de bajo peso molecular de 220, 250 y 325 kilobases...

Anticuerpos monoclonales específicos de especies desarrollados contra Leishmania (Viannia) equatorensis

Se obtuvieron anticuerpos monoclonales contra promastigotes de Leishmania (Viannia), que fue recientemente descrita como una nueva especie (Grimaldi et al., 1992) Ratones BALB/c fueron inmunizados con homogenados de L. (v) equatorensis (promastigotes) obtenidos de un cultivo in vitro de 10 días. La fusión de células esplénicas inmunizadas con células de mieloma P3-X63-Ag8,6.5.3 resultó en la producción de 6 anticuerpos monoclonales (AcMs) contra L. (v) equatorensis. Entre estos, 5, AcMs 9F4, 7H6, 3A7, 8C1 y 1G5 se revelaron como específicos contra L (v) equatorensis por medio de ELISA contra un panel cruzado de cepas de Leishmania. Estos AcMs constituirán, por tanto, un útil incremento para el panel de ancicuerpos...

Estudios de la composición de la fauna flebotomínica y su actividad de picadura al hombra en área endémica de leishmaniasis del Ecuador

Los aspectos biológicos de varias especies antropofilicas de flebotominos fueron examinados en dos áreas endémicas de leishmaniasis. En el sitio de estudio I (350m-600m sobre el nivel del mar) localizado en la estribación andina, se examinaron cuidadosamente la densidad de población, actividad de picadura e índice de infección natural con promastoigotes de Leishmania, y los resultados obtenidos fueron comparados con los de 1983, y 1991/1993. Los datos revelaron que hubo una gran diferencia entre los dos sitios de estudio (1983 y 1991/1993). En el sitio de estudio II (400m s.n.m), localizado en la cordillera de la región costera del Pacífico, la composición de especies y la actividad de picadura fueron examinadas...

Investigación sobre la infección natural de flebotominos, Lutzomya spp., con Leishmania en un área endémica, km 101, Provincia de Manabí, Ecuador

Seis especies antropofílicas de Lutzomya, Lu. gomezi, Lu hartmanni, Lu serrana, Lu. trapidoi, Lu shannoni y Lu. panamensis, fueron examinadas en busca de su infección natural con promastigotes de Leishmania, en un área endémica de esta enfermedad, Km 101 (vía Manta-Quevedo), Provincia de Manabí. Un total de 2,530 ejemplares fueron disecados, pero no se encontró infección natural. En el texto, el ciclo de transmisión de leishmaniasis en el área fue brevemente discutido.

Paridad de Lutzomya spp., colectadas en diferentes áreas endémicas de leishmaniasis en Ecuador

Se examinó cuidadosamente el desarrollo folicular de los flebotominos capturados en las tierras bajas y altas del país. El índice de paridad de Lutzomya ayacuchensis fue 9.0 por ciento (10/111) en las colecciones nocturnas, y 9.2 por ciento (9/98) en las colecciones diurnas tempranas en las alturas (Huigra, provincia de Chimborazo). No se encontró diferencia entre los índices de los insectos capturados en dos momentos diferentes (noche y amanecer). Los índices de paridad de Lu. gomezi y Lu. serrana de las tierras bajas (Guayabales y San Sebastián, provincia de Manabí) fueron 14.6 por ciento (7/48) y 0.0 por ciento (0/7), respectivamente. Algunas de las Lu. gomezi colectadas mostraron los niveles de desarrollo II o III...

Un estudio preliminar de la susceptibilidad de los flebotominos para el fenitrothion (Sumithion)

La suceptibilidad de Lutzomya gomezi (adultos) para el fenitrothion (Sumithion, Sumitomo Co., Ltd., Japan), fue probada en el Ecuador. Los flebotominos sometidos a prueba fueron colectados utilizando cebos humanos protegidos. El Sumithion fue diluido con solución de acetona, y aplicado (impregnado) a tablillas sintéticas y papeles filtro. Los flebotominos capturados fueron confinados, posados sobre los materiales impregnados, dentro de recipientes adecuados, por diferentes intervalos de tiempo. Luego, los adultos expuestos fueron transferidos a recipientes de poliestireno sin insecticida. El número de insectos caídos fue contado. Un alto índice de bajas entre los insectos fue observado dentro de los 60-80 minutos...

Breve nota sobre la aplicación de insecticidas para el control de flebotominos endofílicos

En el texto, se discutieron brevemente las medidas de control de los flebotominos especialmente los métodos químicos. Al momento se insiste que el control químico de los flebotominos es uno de los más generales e importantes métodos para la prevención de leishmaniasis. Entre muchos métodos químicos utilizados, como los insecticidas, se revisó y evaluó la eficacia del DDT, malathion, fenitrothion, deltamethrin y permethrin. Más aún, se evaluaron los recientemente desarrollados análogos de hormonas juveniles, pyripfoxyfen y Similav. El uso de hembras tratadas con Sumilav, para el control de flebotominos, fue también discutido brevemente.

Evaluación de ELISA en el diagnóstico de leishmaniasis en el Ecuador

El presente estudio fue diseñado para evaluar ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) como método diagnóstico para la leishmaniasis cutánea en el Ecuador. Se obtuvieron 95 sueros de los habitantes con lesiones cutáneas, en 3 áreas endémicas, San Plácido, Calceta y Junín, en la provincia de Manabí. En base a las manifestaciones químicas, se los dividió en 4 grupos; 11 tenían úlceras leishmaniásicas activas, 13 tenían cicatrices leishmaniásicas sin registro de tratamiento, 27 tenían lesiones leishmaniásicas y habían sido tratados, después de 1991, por nosotros, y 44 fueron considerados como no leishmaniásicos. Los sueros de estos individuos fueron sometidos a ELISA. Los antígenos para ELISA fueron preparados...

Ensayo de quimioterapia utilizando una droga anti-cancerosa (Fluorouracil: 5FU) para leishmaniasis cutánea en el Ecuador

En este artículo, se ha evaluado el efecto de un tratamiento tópico con una droga anticancerosa (fluorouracil: 5FU) en unguento, contra la leishmaniasis cutánea. Un total de 47 pacientes con leishmaniasis cutánea, habitantes de la comunidad de Guayabales, provincia de Manabí, fueron reclutados para este estudio. El unguento 5FU fue preparado a la concentración de 2 por ciento. Entre 7 pacientes tratados con unguento 5FU al 2 por ciento, 1 mejoró evidentemente, 2 mostraron una ligera mejoría y 4 no respondieron. Adicionalmente, en estos 7 casos, ninguno alcanzó curación completa dentro de un mes de tratamiento. Se ha reportado que la aplicación de unguento de paramomicina al 10 por ciento provocó sensaciones de ardor...

Investigación seroepidemiológica de la lepra en áreas endémicas de leishmaniasis cutánea en el Ecuador

Se realizaron exámenes serológicos para lepra en áreas endémicas de leishmaniasis cutánea, utilizando los sueros colectados durante un estudio de leishmaniasis y otras enfermedades parasitarias del Ecuador. No hubo correlación entre los índices de prevalencia de la lepra y los índices seropositivos de los anticuerpos (anticuerpos anti-PGL-I y LAM-B) en los individuos habitantes de algunas provincias de Ecuador. Los índices de positividad de los anticuerpos anti PGL-I de los pacientes leprosos y sus familiares en los Ranchos, provincia de Manabí, fueron relativamente altos (84.6 por ciento, 11/13), en comparación con los de los sujetos de otras áreas del Ecuador (42.2 por ciento, 154/365). Hemos sugerido que la investigación seroepidemiológica de los familiares de los pacientes leprosos podría ser útil...

Reporte de casos de lepra en una área endémica de leishmaniasis cutánea en el Ecuador

Cuatro casos de pacientes con lepra fueron vistos en un área endémica de leishmaniasis cutánea, Los Ranchos, Provincia de Manabí. Dos casos de lepra (lepromatosa borderline e indeterminada, respectivamente) fueron reportados en una sola familia. Un armadillo de 9 bandas, mantenido por la familia, fue examinado, pero no se encontraron bacilos ácido-resistentes en su hígado. Se discute brevemente sobre muestreos realizados a los miembros de las familias de los pacientes leprosos.

Detección de parásitos de Leishmania por amplificación del DNA utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Las técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) han sido aplicadas para la detección de DNA de Leishmania que ha sido aislada de lesiones cutáneas de seres humanos y materiales de biopsia de animales domésticos y silvestres en el Ecuador. La especificidad y sensibilidad de los oligonucleótidos sintetizados que fueron derivados de secuencias parciales de DNA del kinetoplasto de los parásitos, L. braziliensis, han sido probados para la técnica del PCR utilizando 8 cepas de referencia de la OMS, L. braziliensis, L. panamensis, L. guyanensis, L. mexicana, L. amazonensis, L. pifanoi, L. garnhami y L. chagasi, antes de utilizarlos para probar el DNA de los parásitos ecuatorianos. Los resultados obtenidos fueron sumarizados...

Actividad de picadura e infecciones con Leishmania de especies antropofílicas de flebotomios, Lutzomya spp

La actividad de picadura y las infecciones con Leishmania de los flebotominos, Lutzomya spp, han sido estudiadas en 1990 en el Ecuador. Los insectos fueron colectados por medio de cuatro métodos, cebo humano, trampas Shannon iluminadas, aspiración directa de los sitios de reposo diurno y trampas pegantes en 6 localidades. El número total de insectos capturados fue de 2,401 pertenecientes a 12 especies, los promastigotes de Leishmania fueron encontrados en Lutzomya trapidoi, Puerto Quito y Ocaña, y en Lu. hartmanni en otro sitio posterior. La mayoría de los flebotominos antropofilicos vienen al cebo humano alrededor de 2 o 3 horas después del atardecer y alcanzan su hora pico en un momento determinado, entre el crepúsculo y el amanecer...

Transmisión de Leishmania panamensis a los humanos por Lutzomya hartmanni y Lu. trapidoi (Diptera: Pshchodidae) en Ecuador

En este artículo reportamos la transmisión de Leishmania panamensis al hombre por la picadura de flebotominos infectados, Lutzomya hartmanni (Faichild & Hertig) o Lu. trapidoi (F&H) en el Ecuador. Este hallazgo confirma la importancia de estas especies, las que ya fueron conocidas previamente como altamente antropofilicas, y en las cuales se observó ya la infección natural con el parásito Leishmania, en el estudio epidemiológico de la Leishmania realizado en la Provincia del Cañar.

Fauna flebotomínica (Diptera: Pshychodidae) de 9 sitios endémicos de leishmaniasis en el Ecuador

La fauna flebotomínica de 9 sitios endémicos diferentes de leishmaniasis en Ecuador, fue muestrada utilizando una variedad de métodos. Un total de 30 especies fueron colectadas y 3 especies de Lutzomya, Lu, saulensis, Lu, furcata y Lu. strictivilla, fueron registradas por primera vez en el Ecuador. El género Warileya fue también registrado en el país por primera vez, representado por W. pheblotomanica Hertig. Por primera vez se realizaron capturas de flebotominos en la Provincia de Loja, al sur del Ecuador. Las listas ya conocidas de 23 especies, fueron aumentadas a 36 nuevos registros provinciales.