ABSTRACT
The level of hydrogen peroxide (H2O2) in plants signalizes the induction of several genes, including that of ascorbate peroxidase (APX-EC 1.11.1.11). APX isoenzymes play a central role in the elimination of intracellular H2O2 and contribute to plant responses to diverse stresses. During the infection process in Theobroma cacao by Moniliophthora perniciosa oxidative stress is generated and the APX action recruited from the plant. The present work aimed to characterize the T. cacao APX involved in the molecular interaction of T. cacao-M. perniciosa. The peroxidase activity was analyzed in protein extracts from cocoa plants infected by M. perniciosa and showed the induction of peroxidases like APX in resistant cocoa plants. The cytosolic protein of T. cacao (GenBank: ABR68691.2) was phylogenetically analyzed in relation to other peroxidases from the cocoa genome and eight genes encoding APX proteins with conserved domains were also analyzed. The cDNA from cytosolic APX was cloned in pET28a and the recombinant protein expressed and purified (rTc-cAPX). The secondary structure of the protein was analyzed by Circular Dichroism (CD) displaying high proportion of α-helices when folded. The enzymatic assay shows stable activity using ascorbate and guaiacol as an electron donor for H2O2 reduction. The pH 7.5 is the optimum for enzyme activity. Chromatographic analysis suggests that rTc-cAPX is a homodimer in solution. Results indicate that the rTc-cAPX is correctly folded, stable and biochemically active. The purified rTc-cAPX presented biotechnological potential and is adequate for future structural and functional studies.
Subject(s)
Agaricales , Ascorbate Peroxidases , Cacao , Disease Resistance , Oxidative Stress , Plant Diseases/microbiology , Plant Proteins , Ascorbate Peroxidases/chemistry , Ascorbate Peroxidases/genetics , Ascorbate Peroxidases/metabolism , Cacao/enzymology , Cacao/genetics , Cacao/microbiology , Cytosol , DNA, Complementary , Dimerization , Disease Resistance/genetics , Gene Expression Regulation, Plant , Genes, Plant , Hydrogen Peroxide/metabolism , Hydrogen-Ion Concentration , Phylogeny , Plant Proteins/chemistry , Plant Proteins/genetics , Plant Proteins/metabolism , Protein Folding , Protein Structure, Secondary , Recombinant Proteins/isolation & purification , Recombinant Proteins/metabolismABSTRACT
Segundo a Organização Mundial de Saúde (2002), a esquistossomose é a segunda maior doença tropical, causadora de 200 a 300 mil mortes por ano. Mesmo apresentando alguns quimioterápicos eficazes para o tratamento, como o praziquantel (PZQ) e a oxamniquina (OXQ), ocorrem muitos casos refratários e efeitos colaterais. Diante deste contexto, é necessária a busca racional de novos medicamentos e combinações para o tratamento desta doença. Uma possível solução é o estudo de drogas relacionadas com o estresse oxidativo do patógeno. Dentre estas podem ser analisadas: a artemisinina (ART) , que induz uma maior produção de radicais livres por inibição da formação da hemozoína em Plasmodium falciparum; a butionina sulfoximina (850), que impede a produção da glutationa; além do dietilditiocarbamato de sódio (DDC), que age como inibidor das superóxido dismutases. Portanto, o objetivo deste trabalho foi testar in vitro essas drogas, isoladas e combinadas, analisando a atividade das superóxido dismutases, alterações morfológicas e produção de hemozoína em vermes adultos, além de avaliar a toxicidade em esplenócitos. A ART apresentou efeito esquistossomicida em concentrações elevadas. O DDC mostrou um efeito esquistossomicida satifatório e inibiu as superóxido dismutases. Quanto à associação ART - DDC, esta inibiu a formação da hemozoína, apresentou danos nos tegumentos dos vermes e não apresentou citotoxicidade significativa. Estes resultados indicam que estas drogas são viáveis para estudos in vivo, podendo ser uma nova alternativa quimioterápica para esta patologia.