Immunogenomic screening approach to identify new antigens for the serological diagnosis of chronic Chagas' disease.

Serological tests are preferentially used for the diagnosis of Chagas' disease (CD) during the chronic phase because of the low parasitemia and high anti-Trypanosoma cruzi antibody titers. However, the current methods showed several disadvantages, as contradictory or inconclusive results, mainly related to the characteristics of the antigens used, in general, crude or whole parasites, but also due to antigen production protocol and the experimental conditions used in serological tests. Thus, better-quality serological assays are urgently needed. Here, we performed a wide immunogenomic screen strategy to identify conserved linear B-cell epitopes in the predicted proteome based on genome sequence from T. cruzi strains to will be applied as synthetic peptides in the serodiagnosis of the chronic CD. Three B-cell epitopes derived from mucin-associated surface protein (MASP) family, expressed in both infective parasite stages, trypomastigote and amastigotes, conserved in T. cruzi strains, and highly divergent as compared with Leishmania spp. proteome, were selected for this study. The results demonstrated that synthetic peptide 2 and a mixture of peptides (Mix II: peptides 2 and 3) were able to identify all chronic CD cases, indeterminate or Chagas cardiomyopathy clinical presentation, and simultaneously able to discriminate infections caused by Leishmania parasites, with high accuracy (98.37 and 100.00%, respectively) and agreement (kappa index = 0.967 and 1.000, respectively) with direct methods as compared to current diagnostic pipeline performed by reference laboratories in Brazil. This study represents an interesting strategy for the discovery of new antigens applied to serologic diagnosis of infectious diseases and for the technological development of platforms for large-scale production of diagnostic tests.

Current situation and perspectives regarding human Chagas disease in midwestern of the state of Minas Gerais, Brazil.

Recognising the importance of Chagas disease in Brazil, Bambuí set up epidemiological surveillance for Chagas disease in 1974 and was the first municipality to do so. To ascertain the current epidemiology of Chagas disease in this municipality, 1.782 blood samples from the general population were analysed; 7.7% of samples were found to be seropositive for Chagas disease. A strong positive correlation between increasing age and Chagas disease was evident in both genders, with the highest prevalence in individuals aged over 60 years. Clinically, the cardiodigestive form of Chagas disease was the most common in these samples. These data confirm the interruption of Trypanosoma cruzi transmission, in parallel with a still important residual morbidity of Chagas disease in the county, thus supporting political decisions that will prioritise epidemiological surveillance and medical treatment of Chagas disease in the coming years.

Doença de Chagas em Bambuí: estado atual e vigilância

Cenário de importantes atividades no controle da doença de Chagas (DCh),Bambuí foi o primeiro município brasileiro a alcançar a vigilância epidemiológica em 1974. O presente trabalho buscou caracterizar a atual situação epidemiológica da doença de Chagas no município de Bambuí, identificando principais grupos afetados, formas clínicas predominantes e grupos do parasito circulantes nos pacientes. Foram amostrados 1.782 indivíduos, dos quais 138 (7,7%) foram soro reagentes para T. cruzi. Para ambos os gêneros predominaram soros positivos acima dos 60 anos de idade, sendo detectadas duas mulheres mais jovens (32 e 40 anos) infectadas. Nos pacientes clinicamente avaliados, foi possível diagnosticar as formas clínicas digestiva (7/101), indeterminada (14/101), cardíaca (30/101) e cardiodigestiva (50/101), bem como a presença do grupo DTU TcII, excetuando apenas dois casos de infecção mista (DTU TcI e TcII). Dos 5.429 óbitos ocorridos em Bambuí ao longo de 31 anos, 638 (11,8%) foram devido à DCh, sendo 54,5%(348/638) referente ao sexo masculino, 45,1% (288/638) ao sexo feminino e 0,3%(2/638) tiveram registro de sexo ignorado. A faixa etária na qual se registrou o maior número de óbitos no município foi de 60 a 69 anos. Com relação à morbidade,observou-se um total 22 registros de internações em Bambuí pelo Sistema Único de Saúde no período de 1984 a 2007, sendo 7 (31,82%) referentes à homens e 15(38,69%) à mulheres. Este trabalho pode servir como um alerta ao cuidado dos pacientes crônicos que ainda requerem atenção médica especializada e reforça a necessidade de constantes medidas de vigilância epidemiológica à endemia chagásica no município de Bambuí.

Doença de Chagas em Bambuí: estado atual e vigilância / Chagas disease in Bambuí: current status and surveillance

Cenário de importantes atividades no controle da doença de Chagas (DCh),Bambuí foi o primeiro município brasileiro a alcançar a vigilância epidemiológica em 1974. O presente trabalho buscou caracterizar a atual situação epidemiológica da doença de Chagas no município de Bambuí, identificando principais grupos afetados, formas clínicas predominantes e grupos do parasito circulantes nos pacientes. Foram amostrados 1.782 indivíduos, dos quais 138 (7,7%) foram soro reagentes para T. cruzi. Para ambos os gêneros predominaram soros positivos acima dos 60 anos de idade, sendo detectadas duas mulheres mais jovens (32 e 40 anos) infectadas. Nos pacientes clinicamente avaliados, foi possível diagnosticar as formas clínicas digestiva (7/101), indeterminada (14/101), cardíaca (30/101) e cardiodigestiva (50/101), bem como a presença do grupo DTU TcII, excetuando apenas dois casos de infecção mista (DTU TcI e TcII). Dos 5.429 óbitos ocorridos em Bambuí ao longo de 31 anos, 638 (11,8%) foram devido à DCh, sendo 54,5%(348/638) referente ao sexo masculino, 45,1% (288/638) ao sexo feminino e 0,3%(2/638) tiveram registro de sexo ignorado. A faixa etária na qual se registrou o maior número de óbitos no município foi de 60 a 69 anos. Com relação à morbidade,observou-se um total 22 registros de internações em Bambuí pelo Sistema Único de Saúde no período de 1984 a 2007, sendo 7 (31,82%) referentes à homens e 15(38,69%) à mulheres. Este trabalho pode servir como um alerta ao cuidado dos pacientes crônicos que ainda requerem atenção médica especializada e reforça a necessidade de constantes medidas de vigilância epidemiológica à endemia chagásica no município de Bambuí...

Applicability of an optimized non-conventional flow cytometry method to detect anti-Trypanosoma cruzi immunoglobulin G for the serological diagnosis and cure assessment following chemotherapeutic treatment of Chagas disease.

One of the challenges on immunodiagnostic of Chagas disease in endemic areas has been the search for more practical and safe antigenic preparation that provides tests with higher sensitivity and specificity, with low cross-reactivity. A new approach using fixed Trypanosoma cruzi epimastigotes to detect IgG reactivity was investigated previously. In order to continue this investigation, this study aimed at optimizing the flow cytometry-based method to the diagnosis of Chagas disease patients after specific chemotherapy. To achieve our goal, serum samples from 93 subjects - 52 adults chronically infected by T. cruzi, and 41 uninfected controls were tested by flow cytometry. Secondly, serum samples from patients Treated Cured and Treated Uncured from Chagas disease were also tested to evaluate the potential of the method on assessing cure. After establishing the ideal serum dilution and cut off, 121 serum samples from patients with other endemic infections were tested to check cross-reactivity. The results showed that parasite staining with Evan's blue dye eliminated debris, allowing trustworthy analysis of anti-fixed epimastigote IgG reactivity. The applicability of the method to diagnose Chagas disease was confirmed by the high sensitivity (98.1%) and specificity (100%) found. This method also contributed for post-therapeutic assessment of cure, identifying 94.1% of Treated Uncured and 83.3% of Treated Cured patients. Cross-reactivity was observed in a very low number (6.7%). On the whole, these data highly recommend the use of anti-fixed T. cruzi epimastigote IgG reactivity by flow cytometry to the diagnosis and cure monitoring of Chagas disease in endemic areas.

Pesquisa de IgG anti-formas epimastigotas fixadas de Trypanosoma cruzi por citometria de fluxo: otimização e análise de desempenho, aplicada ao diagnóstico e monitoração de cura da Doença de chagas

Um dos grandes desafios enfrentados por pesquisadores no campo da propedêutica sorológica complementar tem sido a busca da melhor preparação antigênica para as aplicações no âmbito do imunodiagnóstico de doenças infecto-parasitárias visando maior sensibilidade e especificidade dos testes. Uma nova metodologia de pesquisa de IgG anti-formas epimastigotas fixadas (FC-AFEA-IgG), baseada na citometria de fluxo, tem se mostrado um instrumento alternativo para o diagnóstico e monitoração de cura da infecção crônica por Trypanosoma cruzi. Dando continuidade a esta investigação, o objetivo desse trabalho foi otimizar e avaliar os índices de desempenho da FCAFEA- IgG, principalmente no que se refere ao diagnóstico sorológico da doença de Chagas. Neste estudo, foram selecionados um total de 255 indivíduos, dentre eles, 52 pacientes adultos cronicamente infectados por T. cruzi (CH) e 41 indivíduos não-infectados (NI) para avaliação da FC-AFEA-IgG no diagnóstico.

Para a avaliação na monitoração de cura pós-tratamento etiológico da doença de Chagas, foram analisadas 24 amostras de soro de pacientes tratados curados (TC) e 17 amostras de soro de pacientes tratados, porém, não-curados (TNC). Adicionalmente, foram testadas 121 amostras de soro de indivíduos portadores de outras doenças infecto-parasitárias: esquistossomose mansônica, malária, toxoplasmose, HLTV, HIV, Hepatite B, Hepatite C, sífilis, leishmanioses visceral e tegumentar. Todas as amostras foram submetidas a testes de sorologia convencional específicos para o diagnóstico da doença de Chagas. Os resultados de otimização demonstraram que alterações metodológicas relacionadas com a utilização de anticorpo secundário anti-Fc-IgG, a ampliação da faixa de diluição das amostras-teste (1:16 a 1:32.768) e eliminação de ‘debris’ pela utilização do corante vital azul de Evans para marcação dos parasitos, permitiram melhor desempenho da FCAFEA-IgG modificada quando comparada com a original. Em síntese, nossos resultados demonstraram que, empregando a diluição do soro 1:2.048 e o valor de 60% de PPFP como ponto de corte, o estudo da reatividade sorológica de IgG anti-formas epimastigotas fixadas de T. cruzi aplica-se ao diagnóstico e à monitoração de cura pós-tratamento etiológico da doença de Chagas com índices de sensibilidade e especificidade de 97,1% e 95,4%, respectivamente

Pesquisa de IgG anti-formas epimastigotas fixadas de Trypanosoma cruzi por citometria de fluxo: otimização e análise de desempenho, aplicada ao diagnóstico e monitoração de cura da Doença de chagas / Search IgG anti-fixed epimastigotes of Trypanosoma cruzi by flow cytometry: optimization and performance analysis applied to the diagnosis and monitoring of Chagas disease cure

Um dos grandes desafios enfrentados por pesquisadores no campo da propedêutica sorológica complementar tem sido a busca da melhor preparação antigênica para as aplicações no âmbito do imunodiagnóstico de doenças infecto-parasitárias visando maior sensibilidade e especificidade dos testes. Uma nova metodologia de pesquisa de IgG anti-formas epimastigotas fixadas (FC-AFEA-IgG), baseada na citometria de fluxo, tem se mostrado um instrumento alternativo para o diagnóstico e monitoração de cura da infecção crônica por Trypanosoma cruzi. Dando continuidade a esta investigação, o objetivo desse trabalho foi otimizar e avaliar os índices de desempenho da FCAFEA- IgG, principalmente no que se refere ao diagnóstico sorológico da doença de Chagas. Neste estudo, foram selecionados um total de 255 indivíduos, dentre eles, 52 pacientes adultos cronicamente infectados por T. cruzi (CH) e 41 indivíduos não-infectados (NI) para avaliação da FC-AFEA-IgG no diagnóstico.

Para a avaliação na monitoração de cura pós-tratamento etiológico da doença de Chagas, foram analisadas 24 amostras de soro de pacientes tratados curados (TC) e 17 amostras de soro de pacientes tratados, porém, não-curados (TNC). Adicionalmente, foram testadas 121 amostras de soro de indivíduos portadores de outras doenças infecto-parasitárias: esquistossomose mansônica, malária, toxoplasmose, HLTV, HIV, Hepatite B, Hepatite C, sífilis, leishmanioses visceral e tegumentar. Todas as amostras foram submetidas a testes de sorologia convencional específicos para o diagnóstico da doença de Chagas. Os resultados de otimização demonstraram que alterações metodológicas relacionadas com a utilização de anticorpo secundário anti-Fc-IgG, a ampliação da faixa de diluição das amostras-teste (1:16 a 1:32.768) e eliminação de ‘debris’ pela utilização do corante vital azul de Evans para marcação dos parasitos, permitiram melhor desempenho da FCAFEA-IgG modificada quando comparada com a original. Em síntese, nossos resultados demonstraram que, empregando a diluição do soro 1:2.048 e o valor de 60% de PPFP como ponto de corte, o estudo da reatividade sorológica de IgG anti-formas epimastigotas fixadas de T. cruzi aplica-se ao diagnóstico e à monitoração de cura pós-tratamento etiológico da doença de Chagas com índices de sensibilidade e especificidade de 97,1% e 95,4%, respectivamente