Wnt signaling is involved in crotalphine-induced analgesia in a rat model of neuropathic pain

The aberrant activation of Wnt/β-catenin and atypical Wnt/Ryk signaling pathways in the spinal cord is critical for the development and maintenance of neuropathic pain. Crotalphine is a structural analog to a peptide first identified in Crotalus durissus terrificus snake venom, which induces antinociception by activating kappa-opioid and CB2 cannabinoid receptors. Consistent with previous data, we showed that the protein levels of the canonical Wnt/β-catenin and the atypical Wnt/Ryk signaling pathways are increased in neuropathic rats. Importantly, the administration of crotalphine downregulates these protein levels, including its downstream cascades, such as TCF4 from the canonical pathway and NR2B glutamatergic receptor and Ca2+-dependent signals, via the Ryk receptor. The CB2 receptor antagonist, AM630, abolished the crotalphine-induced atypical Wnt/Ryk signaling pathway activation. However, the selective CB2 agonist affects both canonical and non-canonical Wnt signaling in the spinal cord. Next, we showed that crotalphine blocked hypersensitivity and significantly decreased the concentration of IL-1ɑ, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-18, TNF-ɑ, MIP-1ɑ and MIP-2 induced by intrathecal injection of exogenous Wnt-3a agonist. Taken together, our findings show that crotalphine induces analgesia in a neuropathic pain model by down-regulating the canonical Wnt/β-catenin and the atypical Wnt/Ryk signaling pathways and, consequently controlling neuroinflammation. This effect is, at least in part, mediated by CB2 receptor activation. These results open a perspective for new approaches that can be used to target Wnt signaling in the context of chronic pain.

Papel da enzima aldeído desidrogenase-2 e de aldeídos reativos na dor neuropática / The role of Aldehyde Dehydrogenase-2 enzyme and reactive Aldehydes in neuropathie pain

Neuropathie pain control is a chall.enge and unmet clinical need. Aldehyde dehydrogenase-2 (ALOH2) is a mitochondrial enzyme responsible for the metabolism of reactive aldehydes, such as acetaldehydes, 4-hidroxinonenal (4-HNE) and malondialdehyde (MOA). The endogenous generation of reactive aldehydes occurs upon oxidative stress and lipid peroxidation. Our group demonstrated that reactive aldehydes are directly involved with the genesis of acute pain, once that Alda-1, a small molecule that selectively activates the ALOH2 induces analgesia by reducing the levels of these reactive aldehydes in the inflamed tissue. However, the role of this enzyme in neuropathie pain is still unknow. Therefore, the aim of this project was to investigate if the sustained activation of ALOH2 is able to control the development of neuropathie pain in mice. Thus, we used two strategies: (a) ALOH2 loss of function, by using a transgenic mice that carriers an inactivating point mutation in ALOH2 (ALOH2*2) or pharmacological inhibition of ALOH2 (Aldi) and (b) gain of function, by giving Alda-1 to mice. Wild type mice C57/BL were used as control group. Neuropathy was induced by the chronic constriction of the sciatic nerve (CCI). The nociceptive threshold was determined before and during 28 days after surgery, by the von-Frey filaments method. After the nociceptive evaluation, samples of tissues involved in the nociceptive pathway, such as spinal cord, dorsal root ganglia (ORG), sciatic nerve and blood were obtained for the detection of 4-HNE adducts by Western Blot or competitive ELISA assay. MOA was quantified by detection of reactive substances to thiobarbituric acid (TSARS). Our results showed that the CCI reduces the nociceptive threshold (hyperalgesia), both on wild type mice and ALOH2*2, for the entire period of observation (28 days). Alda-1 blocks the hyperalgesia-induced by CCI in the wild type mice. This effect persists for 14 days and is no longer detected on days 21th and 28th. Regarding the ALOH2*2 animals, Alda-1 induces analgesia for 14 days. This effect is partial on 21th and 28th days. The biochemical assays demonstrated that the CCI did not alter the levels of 4-HNE adducts with proteins from the spinal cord, sciatic nerve or ORG. Interestingly, elevation on the levels of 14 these aldehyde were evaluated in serum, 7 days after CCI. The systemic increasing in 4-HNE is accompanied by the elevation of MD.A in the sciatic nerve. These alterations are controlled by the sustained activation of ALDH2 by Alda-1. Alterations of this aldehydes were not detected in ALDH2*2 mice. On the other hand, the inhibition of ALDH2 by Aldi, contributed for the MOA sciatic nerve accumulation in the of operated mice, 28 days afterwards. Together, our data indicates that Alda-1 presents analgesic effect in neuropathie pain models. This effect seems to be due the inhibition of circulating aldehydes and accumulation at the injury site. Thereby, ALDH2 could be a new therapeutic for the neuropathie pain control.

O controle da dor neuropática é um desafio e uma necessidade clínica não atendida. A aldeído-desidrogenase 2 (ALDH2) é uma enzima mitocondrial responsável pelo metabolismo de aldeídos reativos, incluindo o acetaldeído, 4-hidroxinonenal (4-HNE) e malondialdeído (MOA). A geração endógena de aldeídos reativos ocorre sob estresse oxidative e peroxidação lipídica. Nosso grupo demonstrou que aldeídos reativos estão diretamente relacionados com a gênese da dor aguda inflamatória, uma vez que a Alda-1, uma pequena molécula que ativa seletivamente a ALDH2 induz analgesia por reduzir os níveis desses aldeídos no tecido inflamado. No entanto, o papel dessa enzima na dor neuropática é desconhecido. Portanto, o objetivo deste projeto foi investigar se a ativação sustentada da ALDH2 seria capaz de controlar a dor neuropática em camundongos. Para tanto, utilizamos duas estratégias: (a) perda de função da ALDH2, por meio da utilização de camundongos transgênicos portadores de uma mutação que inativa a ALDH2 (ALDH2*2) ou inibição farmacológica da ALDH2 (Aldi) e (b) ganho de função da ALDH2, por meio da administração de Alda-1. Animais selvagens C57/BL foram utilizados como controle. A neuropatia foi induzida pela constrição crônica do nervo isquiático (CCI). O limiar nociceptive foi determinado, antes e por 28 dias após a cirurgia, utilizando o método de filamentos de von Frey. Após a avaliação nociceptiva, amostras de tecidos envolvidos nas vias nociceptivas como a medula espinal, gânglio da raiz dorsal (DRG), nervo isquiático e sangue foram obtidas para detecção de adutos de 4-HNE por Western blot ou ensaio de ELISA competitivo. O MOA foi quantificado por detecção de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). Nossos resultados mostraram que CCI diminuiu o limiar nociceptive (hiperalgesia), tanto nos camundongos selvagens quanto ALDH2*2, por todo o período de observação, ou seja, 28 dias). A Alda-1 bloqueia a hiperalgesia induzida pela CCI nos animais selvagens por 14 dias. Esse efeito não é mais detectado no 21º e 28° dias. Com relação aos animais ALDH2*2, a Alda-1 induz analgesia por 14 dias. Este efeito analgésico é parcial no 21° e 28° dias. Os ensaios bioquímicos demonstraram que a 12 CCI não alterou os níveis de adutos de 4-HNE com proteínas da medula espinhal, nervo isquiático ou DRG. lnteressantemente, detectamos aumento nos níveis deste aldeído no soro de animais, 7 dias após a CCI. A elevação sistêmica de 4-HNE é acompanhada de aumento de MOA no nervo isquiático. A elevação desses aldeídos é controlada pela ativação sustentada da ALDH2 pela Alda-1. Não detectamos alteração significante nos níveis desses aldeídos em animais ALDH2*2. Por outro lado, a inibição da ALDH2 pela Aldi favoreceu o acúmulo de MOA no nervo isquiático de animais operados, 28 dias após a CCI. Em conjunto, nossos resultados indicam que a Alda-1 apresenta efeito analgésico em modelo de neuropatia. Esse efeito parece ser decorrente da inibição de aldeídos circulantes e do seu acúmulo no local da lesão. Assim, a ALDH2 pode ser um novo alvo terapêutico para o controle da dor neuropática.

Papel da enzima aldeído desidrogenase-2 e de aldeídos reativos na dor neuropática / The role of Aldehyde Dehydrogenase-2 enzyme and reactive Aldehydes in neuropathie pain

Neuropathie pain control is a chall.enge and unmet clinical need. Aldehyde dehydrogenase-2 (ALOH2) is a mitochondrial enzyme responsible for the metabolism of reactive aldehydes, such as acetaldehydes, 4-hidroxinonenal (4-HNE) and malondialdehyde (MOA). The endogenous generation of reactive aldehydes occurs upon oxidative stress and lipid peroxidation. Our group demonstrated that reactive aldehydes are directly involved with the genesis of acute pain, once that Alda-1, a small molecule that selectively activates the ALOH2 induces analgesia by reducing the levels of these reactive aldehydes in the inflamed tissue. However, the role of this enzyme in neuropathie pain is still unknow. Therefore, the aim of this project was to investigate if the sustained activation of ALOH2 is able to control the development of neuropathie pain in mice. Thus, we used two strategies: (a) ALOH2 loss of function, by using a transgenic mice that carriers an inactivating point mutation in ALOH2 (ALOH2*2) or pharmacological inhibition of ALOH2 (Aldi) and (b) gain of function, by giving Alda-1 to mice. Wild type mice C57/BL were used as control group. Neuropathy was induced by the chronic constriction of the sciatic nerve (CCI). The nociceptive threshold was determined before and during 28 days after surgery, by the von-Frey filaments method. After the nociceptive evaluation, samples of tissues involved in the nociceptive pathway, such as spinal cord, dorsal root ganglia (ORG), sciatic nerve and blood were obtained for the detection of 4-HNE adducts by Western Blot or competitive ELISA assay. MOA was quantified by detection of reactive substances to thiobarbituric acid (TSARS). Our results showed that the CCI reduces the nociceptive threshold (hyperalgesia), both on wild type mice and ALOH2*2, for the entire period of observation (28 days). Alda-1 blocks the hyperalgesia-induced by CCI in the wild type mice. This effect persists for 14 days and is no longer detected on days 21th and 28th. Regarding the ALOH2*2 animals, Alda-1 induces analgesia for 14 days. This effect is partial on 21th and 28th days. The biochemical assays demonstrated that the CCI did not alter the levels of 4-HNE adducts with proteins from the spinal cord, sciatic nerve or ORG. Interestingly, elevation on the levels of 14 these aldehyde were evaluated in serum, 7 days after CCI. The systemic increasing in 4-HNE is accompanied by the elevation of MD.A in the sciatic nerve. These alterations are controlled by the sustained activation of ALDH2 by Alda-1. Alterations of this aldehydes were not detected in ALDH2*2 mice. On the other hand, the inhibition of ALDH2 by Aldi, contributed for the MOA sciatic nerve accumulation in the of operated mice, 28 days afterwards. Together, our data indicates that Alda-1 presents analgesic effect in neuropathie pain models. This effect seems to be due the inhibition of circulating aldehydes and accumulation at the injury site. Thereby, ALDH2 could be a new therapeutic for the neuropathie pain control.

O controle da dor neuropática é um desafio e uma necessidade clínica não atendida. A aldeído-desidrogenase 2 (ALDH2) é uma enzima mitocondrial responsável pelo metabolismo de aldeídos reativos, incluindo o acetaldeído, 4-hidroxinonenal (4-HNE) e malondialdeído (MOA). A geração endógena de aldeídos reativos ocorre sob estresse oxidative e peroxidação lipídica. Nosso grupo demonstrou que aldeídos reativos estão diretamente relacionados com a gênese da dor aguda inflamatória, uma vez que a Alda-1, uma pequena molécula que ativa seletivamente a ALDH2 induz analgesia por reduzir os níveis desses aldeídos no tecido inflamado. No entanto, o papel dessa enzima na dor neuropática é desconhecido. Portanto, o objetivo deste projeto foi investigar se a ativação sustentada da ALDH2 seria capaz de controlar a dor neuropática em camundongos. Para tanto, utilizamos duas estratégias: (a) perda de função da ALDH2, por meio da utilização de camundongos transgênicos portadores de uma mutação que inativa a ALDH2 (ALDH2*2) ou inibição farmacológica da ALDH2 (Aldi) e (b) ganho de função da ALDH2, por meio da administração de Alda-1. Animais selvagens C57/BL foram utilizados como controle. A neuropatia foi induzida pela constrição crônica do nervo isquiático (CCI). O limiar nociceptive foi determinado, antes e por 28 dias após a cirurgia, utilizando o método de filamentos de von Frey. Após a avaliação nociceptiva, amostras de tecidos envolvidos nas vias nociceptivas como a medula espinal, gânglio da raiz dorsal (DRG), nervo isquiático e sangue foram obtidas para detecção de adutos de 4-HNE por Western blot ou ensaio de ELISA competitivo. O MOA foi quantificado por detecção de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). Nossos resultados mostraram que CCI diminuiu o limiar nociceptive (hiperalgesia), tanto nos camundongos selvagens quanto ALDH2*2, por todo o período de observação, ou seja, 28 dias). A Alda-1 bloqueia a hiperalgesia induzida pela CCI nos animais selvagens por 14 dias. Esse efeito não é mais detectado no 21º e 28° dias. Com relação aos animais ALDH2*2, a Alda-1 induz analgesia por 14 dias. Este efeito analgésico é parcial no 21° e 28° dias. Os ensaios bioquímicos demonstraram que a 12 CCI não alterou os níveis de adutos de 4-HNE com proteínas da medula espinhal, nervo isquiático ou DRG. lnteressantemente, detectamos aumento nos níveis deste aldeído no soro de animais, 7 dias após a CCI. A elevação sistêmica de 4-HNE é acompanhada de aumento de MOA no nervo isquiático. A elevação desses aldeídos é controlada pela ativação sustentada da ALDH2 pela Alda-1. Não detectamos alteração significante nos níveis desses aldeídos em animais ALDH2*2. Por outro lado, a inibição da ALDH2 pela Aldi favoreceu o acúmulo de MOA no nervo isquiático de animais operados, 28 dias após a CCI. Em conjunto, nossos resultados indicam que a Alda-1 apresenta efeito analgésico em modelo de neuropatia. Esse efeito parece ser decorrente da inibição de aldeídos circulantes e do seu acúmulo no local da lesão. Assim, a ALDH2 pode ser um novo alvo terapêutico para o controle da dor neuropática.