Condiciones de adsorción de un candidato vacunal basado en vesículas de membrana externa derivada de Salmonella Paratyphi A en adyuvantes de aluminio / Adsorption conditions of a vacunal candidate based on outer membrane vesicles of Salmonella Paratyphi A in aluminum adjuvants

La capacidad inmunoestimuladora de la mayoría de las vacunas es potenciada mediante la adsorción en adyuvantes que contienen aluminio. Variando las condiciones de adsorción (pH, tiempo de adsorción) cambia la cantidad de antígeno adsorbida y por lo tanto la capacidad de estimulación del sistema inmune. El Instituto Finlay de Vacunas investiga un nuevo candidato vacunal basado en vesículas de membrana externa de Salmonella Paratyphi A (VME-SPA). El objetivo de este trabajo fue determinar las condiciones de adsorción de las VME-SPA en dos adyuvantes de sales de aluminio (Al(OH)3 y AlPO4). Para ello, las VME-SPA fueron adsorbidas en ambos adyuvantes bajo diferentes condiciones de pH y tiempo. Mediante la construcción de una Isoterma de Langmuir se determinaron parámetros como la capacidad adsortiva (qm) y el coeficiente de adsorción (Kd). El lote de VME-SPA empleado estaba formado por poblaciones de nanoestructuras con un tamaño de partículas entre 60 y 100 nm. La adsorción de las VME-SPA en ambos adyuvantes, mostró valores ≥95 por ciento a pH neutro (6,5-7,0). Las VME-SPA en presencia de AlPO4 alcanzaron el estado de equilibrio en menor tiempo (99 por ciento a partir de 30 min) en comparación con Al(OH)3 (95 por ciento a partir de 3 h). Las isotermas evaluadas para ambos adyuvantes cumplieron con el modelo de Langmuir (R2≥0,99), con valores de qm y Kd diferentes entre los sistemas de adsorción. El estudio demostró que las VME-SPA se adsorbieron satisfactoriamente en ambos geles, proceso en el que están involucrados diferentes mecanismos de adsorción(AU)

The immunostimulation capacity of most vaccines is enhanced through antigen adsorption on aluminum adjuvants. The changes in adsorption conditions (pH, adsorption time), could change the amount of antigen adsorbed and therefore the ability to stimulate the immune system. The Finlay Institute of Vaccine researches a new vaccine candidate based on outer membrane vesicle from Salmonella Paratyphi A (OMV-SPA). The study aim was to determine adsorption condition of OMV-SPA with two aluminium adjuvants (Al(OH)3 and AlPO4). OMV-SPA was adsorbed in both adjuvants under differences conditions of pH and time. Parameters as adsorptive capacity (qm) and adsorption coefficient (Kd) were determined by construction of Langmuir Isotherm. The lot of OMV-SPA used is composed by population of nanostructure with a particle size between 60 and 100 nm. Adsorption of OMV-SPA in both adjuvants showed values ≥95 percent in neutral pH (6.5-7.0). OMV-SPA with AlPO4 got equilibrium state in less time (99 percent from 30 min) compared with Al(OH)3 (95 percent from 3 h). Isotherms from both adjuvants described Langmuir model (R2≥0.99), with qm and Kd values very different between adsorption systems. As conclusion, the study showed that OMV-SPA was adsorbed satisfactorily in both aluminium adjuvants, process in which are involved different adsorption mechanism(AU)

Mycobacterium tuberculosis recombinant protein Rv2626c expressed in Streptomyces lividans. Physico-chemical and Immunological characterization as potential vaccine antigen

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) is a leading cause of death globally. Latent tuberculosis infection threatens 1.7 billion people. Mtb latency is mediated by a group of proteins, mainly coded by the Dormancy Safety Regulator (DosR). The protein Rv2626c is the strongest regulated member of this operon. Previous results, including ours, indicate a strong potential of Rv2626c as antigen in a new multiple tuberculosis vaccine. Objectives of this study were to purify the rRv2626c protein and characterize it physico-chemically and immunologically. The purified protein migrates as a sole band after a non-reductive PAGE-silver staining. Under reductive conditions, the dimer isoform appearing at 30.9 kDa prevails over the monomer 15.6 kDa. Mass spectrometry corroborates electrophoresis results regarding dimer molecular weight, of approximately 32 kDa. Six of its digested peptides matched those of HRP-1 protein (Rv2626c) of Mtb whereas 92.1 percent of its amino acid sequence contains three mutations and the addition of an amino acid. With respect to native Mtb protein, 12 of the 13 main epitopes are conserved. Antigenicity was corroborated in volunteers, the antibody responses were significantly higher in a number of infected tuberculosis patients in comparison to healthy Mantoux negative donors as well as in mice immunized with reference Rv2626c, while the immune identification pattern was as expected. The purified protein was able to elicit strong immune response in mice and the resulting antibodies recognized the reference Rv2626c protein. Lastly, the productive specific yield of the Streptomyces lividans strain is sustainable. Taking these results altogether, corroborates our rRv2626c as a promising candidate as antigen for new tuberculosis vaccine formulations(AU)

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) es una de las principales causas de muerte globalmente, la tuberculosis latente amenaza a 1,7 mil millones de personas. En combinación con el VIH-SIDA y otras enfermedades, la tuberculosis puede ser reactivada. La latencia de Mtb está mediada por un grupo de proteínas, principalmente codificadas por el Regulador de Seguridad de Latencia (DosR). La proteína Rv2626c es el miembro más fuertemente regulado de este operón. Los resultados previos, incluidos los nuestros, indican una gran potencialidad de Rv2626c como antígeno en una nueva vacuna múltiple contra la tuberculosis. Los objetivos de este estudio fueron purificar la proteína Rv2626c y caracterizarla fisicoquímica e inmunológicamente. La proteína purificada migra como una banda única después de PAGE con tinción de plata en condiciones no reductoras. En condiciones reductoras, el dímero, de 30,9 kDa, es la isoforma prevaleciente sobre el monómero, de 15,6 kDa. La espectrometría de masas corrobora el peso molecular del dímero, de aproximadamente 32 kDa. Seis de sus péptidos digeridos coincidieron con los de la proteína Rv2626c de Mtb, mientras que se confirmó coincidencia del 92,1 por ciento de su secuencia de aminoácidos, detectándose tres mutaciones y la adición de un aminoácido. Con respecto a la proteína Mtb nativa, se conservan 12 de los 13 epítopes principales. La antigenicidad se corroboró en voluntarios, las respuestas de anticuerpos fueron significativamente mayores en un número de pacientes infectados con tuberculosis en comparación con los donantes negativos de Mantoux sanos, así como en ratones inmunizados con la referencia Rv2626c, mientras que el patrón de identificación inmune fue el esperado. La proteína purificada fue capaz de provocar una fuerte respuesta inmune en ratones y los anticuerpos resultantes reconocieron la proteína de referencia Rv2626c. Por último, el rendimiento productivo específico de la cepa de Streptomyces lividans es sostenible. Tomando estos resultados en conjunto, corrobora nuestra rRv2626c como un candidato prometedor como antígeno para nuevas formulaciones de vacunas contra la tuberculosis(AU)

Influencia del medio de cultivo sobre la cinética de crecimiento y expresión de la proteína recombinante Rv2626c de Mycobacterium tuberculosis H37Rv expresada en Streptomyces lividans TK24 / Influence of the culture medium on the kinetics of growth and expression of the recombinant protein Rv2626c of Mycobacterium tuberculosis H37Rv expressed in Streptomyces lividans TK24

Streptomyces lividans, ha ganado gran atención en los últimos tiempos, como vector de expresión y producción de proteínas de Mycobacterium tuberculosis de interés biomédico, como alternativa a su obtención tradicional en E. coli. La proteína Rv2626c, Proteína de Respuesta Hipóxica 1, es codificada por el gen Rv2626c (hrp1) de M. tuberculosis, perteneciente al regulón de la fase de latencia DosR. Esta proteína se sobre-expresa en la fase de latencia de la tuberculosis bajo condiciones de estrés como hipoxia y bajos niveles, de óxido nítrico. Se ha demostrado la inmunogenicidad y capacidad de esta proteína, de inducir citocinas características del patrón Th-1, tales como el interferón gamma. Por ello, nuestro grupo logró la obtención de Rv2626c por la tecnología del ADN recombinante usando como cepa hospedera Streptomyces lividans TK24. Con el objetivo de aumentar el nivel de expresión de la proteína recombinante, rRv2626c en este trabajo se ensayaron diferentes medios de cultivo, evaluando el crecimiento de la cepa transformada en condiciones de zaranda. Se determinó la cinética de crecimiento en el medio definido, formulado industrialmente en el Centro Nacional de Biopreparados: caldo Triptona Soya (TSB-BioCen) y en medio de cultivo equivalente preparado en el laboratorio. Para establecer la cinética de crecimiento, se utilizó el cálculo del peso seco y la determinación de la concentración de proteínas totales por la técnica de ácido bicinconinico (BCA) a diferentes tiempos del cultivo. Posteriormente, se identificó la proteína clonada mediante SDS-PAGE y Western Blotting, así como los niveles de expresión mediante análisis densitométrico. Los resultados indican que se alcanzaron los máximos niveles de densidad celular a las 36 h de cultivo y los más altos niveles de expresión proteica total y específica entre las 42 y 54 h. Con el medio químicamente definido TSB-Biocen preformulado en lugar del preparado en el laboratorio partiendo de los componentes, se logró reducir el tiempo óptimo para la expresión-secreción de la proteína rv2626c de 96 a 54 h. Los mejores resultados en la promoción de la expresión de la proteína recombinante se lograron con el medio definido TSB-BioCen, a las 48 h con 8,5% de rendimiento específico, superando en más de 10 veces los niveles de crecimiento celular obtenidos con el medio elaborado en el laboratorio y más de dos veces los niveles de secreción de la proteína recombinante(AU)

The use of Streptomyces as a bacterial cell factory for the secretory production of bio-active Mycobacterium tuberculosis proteins have gained a lot of attention in recent years, as a convenient alternative to the traditionally used Escherichia coli. The protein Rv2626c protein, also known as Hypoxic Response Protein 1 (HRP1), is encoded by the gene rv2626c (hrp1) of M. tuberculosis which belongs to the Dormancy Safety Regulator (DosR) regulon. This protein is over-expressed during the latency phase of tuberculosis under stress related conditions such as hypoxia and low, non-toxic, levels of nitric oxide and, the immunogenicity and ability to induce cytokines characteristic of the Th-1 pattern of this protein, such as gamma interferon, have been demonstrated. On this basis, our working group, succeeded in obtaining rRv2626c via recombinant DNA technology using Streptomyces lividans TK24 as the host cell. To improve the expression level of the protein, different culture media were used to evaluate the growth of the transformed strain in shaken flask conditions. Growth kinetic for the recombinant strain was evaluated in defined media of preformulated tryptic soya broth (TSB-Biocen), through the determination of dry weight as well as total protein concentration by Bicinconinic acid assay (BCA). Protein identification was done by SDS-PAGE, Western Blot and its expression level by densitometric analysis. Our results indicated a maximal cell density at 36 h of culture, with higher concentration of total and specific protein at 42-54 h in comparison with previous media used. With the chemically defined media a preformulated TSB-Biocen rather than individual components, culture time for expression/secretion of rRv2626c was reduced from 96 h to 54 h. The best results in expression-secretion levels of rv2626c protein were obtained with the TSB-Biocen defined media at 48 h of culture with 8.5% of specific yield. More than 10 fold increase in cellular growth and more than 2 fold increase in specific yield(AU)

Estandarización de un ELISA para la cuantificación de anticuerpos IgG contra vesículas de membrana externa de Salmonella Paratyphi A / Standardization of an ELISA for the quantification of IgG antibodies against outer membrane vesicle of Salmonella Paratyphi A

Salmonella Paratyphi A es un patógeno exclusivo de humanos, siendo la segunda causa más común de fiebre entérica en el sudeste asiático. Recientemente la incidencia en este continente ha aumentado, desplazando a Salmonella entérica serotipo Typhi como la primera causa de fiebre entérica. En la actualidad no existen vacunas licenciadas contra S. Paratyphi A. El Instituto Finlay de Vacunas se encuentra trabajando en la obtención de un candidato vacunal basado en vesículas de membrana externa (VME) contra S. Paratyphi A, por lo que se hizo necesario contar con una técnica para la evaluación de su inmunogenicidad. El objetivo de este trabajo fue la estandarización de un ELISA para la cuantificación de anticuerpos IgG contra VME de S. Paratyphi A. Para ello, se determinaron las mejores condiciones de este ensayo en cuanto a concentración óptima de recubrimiento y dilución de trabajo del conjugado. Además, se definió el intervalo y linealidad de la curva, la precisión intra e interensayo, la especificidad y el límite de detección. La curva de calibración se generó con un suero estándar interno y presentó un buen ajuste lineal con un R² =0.98. Los coeficientes de variación en los ensayos de precisión intra e interensayo estuvieron en los intervalos establecidos para cada uno (=10 por ciento, =20 por ciento respectivamente). Los resultados obtenidos avalan el empleo de este ELISA cuantitativo para la evaluación de la inmunogenicidad de formulaciones de VME de S. Paratyphi A en fases de investigación y desarrollo(AU)

Salmonella Paratyphi A, is an exclusive pathogen of humans, being the second most common cause of enteric fever in Southeast Asia. Recently the incidence of this disease in this continent has increased, displacing Salmonella enterica serotype Typhi as the first cause of enteric fever. Currently there are no vaccines licensed against S. Paratyphi A. The Finlay Institute of Vaccines is working on obtaining a vaccine candidate based on outer membrane vesicles (VME) against S. Paratyphi A, so it became necessary to develop a technique for the evaluation of its immunogenicity. The objective of this work was the standardization of an ELISA for the quantification of IgG antibodies against VME of S. Paratyphi A. The best conditions of this assay were determined in terms of optimum concentration of coating and working dilution of the conjugate. In addition, the interval and linearity of the curve, the intra- and inter-assay precision, the specificity and the limit of detection were defined. The calibration curve was generated with an internal standard serum and presented a good linear fit with an R² =0.98. The coefficients of variation in the intra- and interassay precision tests were in the intervals established for each one (=10 percent, =20 percent respectively). The results obtained support the use of this quantitative ELISA for the evaluation of the immunogenicity of VME formulations of S. Paratyphi A in research and development phases(AU)

Bioengineered polyester beads co-displaying protein and carbohydrate-based antigens induce protective immunity against bacterial infection.

The efficacy of protein and carbohydrate antigens as vaccines can be improved via particulate delivery strategies. Here, protein and carbohydrate antigens used in formulations of vaccines against Neisseria menigitidis were displayed on in vivo assembled polyester beads using a combined bioengineering and conjugation approach. An endotoxin-free mutant of Escherichia coli was engineered to produce translational fusions of antigens (Neisseria adhesin A (NadA) and factor H binding protein (fHbp) derived from serogroup B) to the polyhydroxybutyrate synthase (PhaC), in order to intracellularly assemble polyester beads displaying the respective antigens. Purified beads displaying NadA showed enhanced immunogenicity compared to soluble NadA. Both soluble and particulate NadA elicited functional antibodies with bactericidal activity associated with protective immunity. To expand the antigen repertoire and to design a more broadly protective vaccine, NadA-PhaC beads were additionally conjugated to the capsular polysaccharide from serogroup C. Co-delivery of surface displayed NadA and the capsular polysaccharide induced a strong and specific Th1/Th17 mediated immune response associated with functional bactericidal antibodies. Our findings provide the foundation for the design of multivalent antigen-coated polyester beads as suitable carriers for protein and polysaccharide antigens in order to induce protective immunity.

Design and Biological Assembly of Polyester Beads Displaying Pneumococcal Antigens as Particulate Vaccine.

Streptococcus pneumoniae can cause life-threatening infections mostly in infants, children, and elderly people. Capsular polysaccharide conjugate vaccines provide serotype-dependent protection against S. pneumoniae infections but fail to protect against new emerging serotypes. To overcome these limitations, pneumolysin (Ply), a serotype-independent and conserved protein was selected. As such subunit vaccines lack immunogenicity, we engineered Ply to be attached to self-assembled polyester beads in order to boost immunogenicity. To display Ply at the surface of these polyester beads, it was translationally fused to the N-terminus of the polyhydroxybutyrate (PHB) synthase (PhaC), which mediates PHB bead assembly inside recombinant Escherichia coli. We also chemically conjugated the capsular polysaccharide (CPS) 19F to isolated PHB beads to further assess their antigen carrier properties. CPS conjugated to soluble tetanus toxoid served as control. Balb/c mice immunized with Ply-PhaC beads and 19F-PhaC beads induced specific and higher IgG levels than the respective soluble counterparts. The induced IgG antibodies recognized Ply in whole cell lysates of six different serotypes of S. pneumoniae. Additionally, restimulated splenocytes from animals immunized with Ply-PhaC beads produced a balanced INF-γ/IL-17A profile unlike animals immunized with soluble Ply. The 19F-PhaC beads induced production of antibodies showing high opsonophagocytic titers against the homologous strain, serotype 19F, while CPS 19F only mixed with PhaC beads did not elicit any detectable immune response. This study provided insight into the design of PHB beads as a carrier of proteinaceous antigens and CPS in order to induce immune responses for the prevention of pneumococcal infections.

Influencia del medio de cultivo sobre la cinética de crecimiento y expresión de la proteína recombinante Rv2626c de Mycobacterium tuberculosis H37Rv expresada en Streptomyces lividans TK24 / Influence of the culture medium on the kinetics of growth and expression of the recombinant protein Rv2626c of Mycobacterium tuberculosis H37Rv expressed in Streptomyces lividans TK24

Streptomyces lividans, ha ganado gran atención en los últimos tiempos, como vector de expresión y producción de proteínas de Mycobacterium tuberculosis de interés biomédico, como alternativa a su obtención tradicional en E. coli. La proteína Rv2626c, Proteína de Respuesta Hipóxica 1, es codificada por el gen Rv2626c (hrp1) de M. tuberculosis, perteneciente al regulón de la fase de latencia DosR. Esta proteína se sobre-expresa en la fase de latencia de la tuberculosis bajo condiciones de estrés como hipoxia y bajos niveles, de óxido nítrico. Se ha demostrado la inmunogenicidad y capacidad de esta proteína, de inducir citocinas características del patrón Th-1, tales como el interferón gamma. Por ello, nuestro grupo logró la obtención de Rv2626c por la tecnología del ADN recombinante usando como cepa hospedera Streptomyces lividans TK24. Con el objetivo de aumentar el nivel de expresión de la proteína recombinante, rRv2626c en este trabajo se ensayaron diferentes medios de cultivo, evaluando el crecimiento de la cepa transformada en condiciones de zaranda. Se determinó la cinética de crecimiento en el medio definido, formulado industrialmente en el Centro Nacional de Biopreparados: caldo Triptona Soya (TSB-BioCen) y en medio de cultivo equivalente preparado en el laboratorio. Para establecer la cinética de crecimiento, se utilizó el cálculo del peso seco y la determinación de la concentración de proteínas totales por la técnica de ácido bicinconinico (BCA) a diferentes tiempos del cultivo. Posteriormente, se identificó la proteína clonada mediante SDS-PAGE y Western Blotting, así como los niveles de expresión mediante análisis densitométrico. Los resultados indican que se alcanzaron los máximos niveles de densidad celular a las 36 h de cultivo y los más altos niveles de expresión proteica total y específica...(AU)

The use of Streptomyces as a bacterial cell factory for the secretory production of bio-active Mycobacterium tuberculosis proteins have gained a lot of attention in recent years, as a convenient alternative to the traditionally used Escherichia coli. The protein Rv2626c protein, also known as Hypoxic Response Protein 1 (HRP1), is encoded by the gene rv2626c (hrp1) of M. tuberculosis which belongs to the Dormancy Safety Regulator (DosR) regulon. This protein is over-expressed during the latency phase of tuberculosis under stress related conditions such as hypoxia and low, non-toxic, levels of nitric oxide and, the immunogenicity and ability to induce cytokines characteristic of the Th-1 pattern of this protein, such as gamma interferon, have been demonstrated. On this basis, our working group, succeeded in obtaining rRv2626c via recombinant DNA technology using Streptomyces lividans TK24 as the host cell. To improve the expression level of the protein, different culture media were used to evaluate the growth of the transformed strain in shaken flask conditions. Growth kinetic for the recombinant strain was evaluated in defined media of preformulated tryptic soya broth (TSB-Biocen), through the determination of dry weight as well as total protein concentration by Bicinconinic acid assay (BCA). Protein identification was done by SDS-PAGE, Western Blot and its expression level by densitometric analysis. Our results indicated a maximal cell density at 36 h of culture, with higher concentration of total and specific protein at 42-54 h in comparison with previous media used. With the chemically defined media a preformulated TSB-Biocen rather than individual components, culture time...(AU)

Estandarización de un ELISA para la cuantificación de anticuerpos IgG contra vesículas de membrana externa de Salmonella Paratyphi A / Standardization of an ELISA for the quantification of IgG antibodies against outer membrane vesicle of Salmonella Paratyphi A

Salmonella Paratyphi A es un patógeno exclusivo de humanos, siendo la segunda causa más común de fiebre entérica en el sudeste asiático. Recientemente la incidencia en este continente ha aumentado, desplazando a Salmonella entérica serotipo Typhi como la primera causa de fiebre entérica. En la actualidad no existen vacunas licenciadas contra S. Paratyphi A. El Instituto Finlay de Vacunas se encuentra trabajando en la obtención de un candidato vacunal basado en vesículas de membrana externa (VME) contra S. Paratyphi A, por lo que se hizo necesario contar con una técnica para la evaluación de su inmunogenicidad. El objetivo de este trabajo fue la estandarización de un ELISA para la cuantificación de anticuerpos IgG contra VME de S. Paratyphi A. Para ello, se determinaron las mejores condiciones de este ensayo en cuanto a concentración óptima de recubrimiento y dilución de trabajo del conjugado. Además, se definió el intervalo y linealidad de la curva, la precisión intra e interensayo, la especificidad y el límite de detección. La curva de calibración se generó con un suero estándar interno y presentó un buen ajuste lineal con un R2 =0.98. Los coeficientes de variación en los ensayos de precisión intra e interensayo estuvieron en los intervalos establecidos para cada uno (=10 por ciento, =20 por ciento respectivamente). Los resultados obtenidos avalan el empleo de este ELISA cuantitativo para la evaluación de la inmunogenicidad de formulaciones de VME de S. Paratyphi A en fases de investigación y desarrollo(AU)

Salmonella Paratyphi A, is an exclusive pathogen of humans, being the second most common cause of enteric fever in Southeast Asia. Recently the incidence of this disease in this continent has increased, displacing Salmonella enterica serotype Typhi as the first cause of enteric fever. Currently there are no vaccines licensed against S. Paratyphi A. The Finlay Institute of Vaccines is working on obtaining a vaccine candidate based on outer membrane vesicles (VME) against S. Paratyphi A, so it became necessary to develop a technique for the evaluation of its immunogenicity. The objective of this work was the standardization of an ELISA for the quantification of IgG antibodies against VME of S. Paratyphi A. The best conditions of this assay were determined in terms of optimum concentration of coating and working dilution of the conjugate. In addition, the interval and linearity of the curve, the intra- and inter-assay precision, the specificity and the limit of detection were defined. The calibration curve was generated with an internal standard serum and presented a good linear fit with an R2 =0.98. The coefficients of variation in the intra- and interassay precision tests were in the intervals established for each one (=10 percent, =20 percent respectively). The results obtained support the use of this quantitative ELISA for the evaluation of the immunogenicity of VME formulations of S. Paratyphi A in research and development phases(AU)