Efeitos antibiofilme e citotóxico de um novo nanosistema carreador de clorexidina e fluconazol / Antibiofilm and cytotoxic effects of a new nanocarrier of chlorhexidine and fluconazole

Os objetivos do presente estudo foram montar e caracterizar um novo nanocarreador dual de clorexidina (CLX) e fluconazol (FLZ), bem como avaliar seu efeito sobre biofilmes microcosmos e sua citotoxicidade sobre queratinócitos orais. Para montar o nanocarreador dual, CLX e FLZ foram adicionados a nanopartículas de óxido de ferro (NPsOF) previamente revestidas por quitosana (QTS), seguido de um processo de solubilização sob agitação magnética. O nanocarreador foi, então, caracterizado por microscopia eletrônica de transmissão, difração de raios X, espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier e análise termogravimétrica. A suscetibilidade de Candida albicans e Candida glabrata no estado planctônico ao nanocarreador dual foi determinada pelos valores de concentração inibitória mínima, utilizando o método da microdiluição em caldo. Um pool de saliva de 2 doadores saudáveis suplementado com espécies de Candida foi usado como inóculo para a formação de biofilmes microcosmos. Os biofilmes foram cultivados (72 h) sobre discos de vidro posicionados no Amsterdam Active Attachment model e tratados (24 h) com NPsOF-QTS carreando 39 µg/mL de CLX + 156 µg/mL de FLZ (NPsOF-QTS-CLX39-FLZ156), 78 µg/mL de CLX + 312 µg/mL de FLZ (NPsOF-QTS-CLX78-FLZ312) e 156 µg/mL de CLX + 624 µg/mL de FLZ (NPsOF-QTS-CLX156-FLZ624). NPsOF (218,5 µg/mL), QTS (218,5 µg/mL) e 156 µg/mL de CLX + 624 µg/mL de FLZ (CLX156-FLZ624) foram testados como controles. Posteriormente, foram realizadas as análises de quantificação das unidades formadoras de colônias (UFCs), produção de ácido lático (LA), composição da matriz extracelular (ME) e viabilidade celular por microscopia confocal de varredura a laser (MCVL). Para o ensaio de citotoxicidade, queratinócitos orais humanos (linhagem NOKsi) foram expostos a diferentes concentrações do nanocarreador dual, por 24 ou 48 h, e a viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de redução de MTT. Os dados foram analisados por ANOVA ou teste de Kruskal-Wallis, seguidos dos testes de Fisher LSD ou Tukey (α = 0,05). Os testes de caracterização físico-química mostraram que um nanocarreador dual com dimensões em torno de 6 nm foi obtido, sem comprometer a propriedade cristalina e a estabilidade de NPsOF. Os compostos que formam o nanocarreador estabeleceram uma interação sinérgica em relação ao efeito sobre células planctônicas de Candida. Para os ensaios de biofilme, NPsOF-QTS-CLX156-FLZ624 foi o composto mais eficaz na redução de UFCs de Streptococcus mutans, Lactobacillus spp., C. albicans e C. glabrata, diferindo significativamente dos outros grupos, e esses achados foram confirmados por MCVL. NPsOF-QTS-CLX39-FLZ156, NPsOF-QTS-CLX78-FLZ312 e CLX156- FLZ624 mostraram efeitos antibiofilme similares. O nanocarreador dual também reduziu significativamente a produção de AL e a quantidade de carboidratos e ácidos nucleicos da ME. Um efeito citotóxico dose-dependente sobre queratinócitos orais foi observado para o nanocarreador dual, independentemente do período de exposição testado (24 ou 48 h). NPsOF-QTS-CLX-FLZ e CLX-FLZ reduziram significativamente a viabilidade dos queratinócitos em concentrações de CLX e FLZ iguais ou superiores a 7,8 e 31,25 µg/mL, respectivamente. Por fim, a nanoterapia testada no presente estudo é promissora e constitui um grande avanço dentro dos métodos alternativos aos antimicrobianos tradicionais para o controle da candidíase oral(AU)

The objectives of the present study were to assemble and characterize a new dual nanocarrier of chlorhexidine (CHX) and fluconazole (FLZ), and evaluate its effect on microcosm biofilms and its cytotoxicity against oral keratinocytes. To assemble the dual nanocarrier, CHX and FLZ were added to iron oxide nanoparticles (IONPs) previously coated by chitosan (CS), followed by a solubilization process under magnetic stirring. The nanocarrier was then characterized by transmission electron microscopy, X-ray diffraction, Fourier transform infrared spectroscopy, and thermogravimetric analysis. The susceptibility of Candida albicans and Candida glabrata in the planktonic state to the dual nanocarrier was determined by the minimum inhibitory concentration values, using the broth microdilution method. A saliva pool from 2 healthy donors supplemented with Candida species was used as an inoculum for microcosm biofilm formation. Biofilms were grown (72 h) on glass discs positioned in the Amsterdam Active Attachment model and treated (24 h) with IONPs-CS carrying 39 µg/mL CHX + 156 µg/mL FLZ (IONPsCS-CHX39-FLZ156), 78 µg/mL CHX + 312 µg/mL FLZ (IONPs-CS-CHX78-FLZ312), and 156 µg/mL CHX + 624 µg/mL FLZ (IONPs-CS-CHX156-FLZ624). IONPs at 218.5 µg/mL, 218.5 µg/mL CS, and 156 µg/mL CHX + 624 µg/mL FLZ (CHX156-FLZ624) were tested as controls. Next, analyses of the quantification of colony-forming units (CFUs), lactic acid production (LA), composition of the extracellular matrix (EM), and viability by confocal laser scanning microscopy (CLSM) were performed. For the cytotoxicity assay, human oral keratinocytes (NOKsi lineage) were exposed to different concentrations of the dual nanocarrier, for 24 or 48 h, and cell viability was determined by the MTT reduction assay. Data were analyzed by ANOVA or Kruskal-Wallis test, followed by Fisher LSD or Tukey tests (α = 0.05). The physico-chemical characterization tests showed that a dual nanocarrier with dimensions around 6 nm was assembled, without compromising the crystalline property and stability of IONPs. The compounds that form the nanocarrier established a synergistic interaction in relation to the effect on Candida planktonic cells. Regarding biofilm assays, IONPs-CS-CHX156-FLZ624 was the most effective compound in reducing CFUs from Streptococcus mutans, Lactobacillus spp., C. albicans, and C. glabrata, differing significantly from the other groups, and these findings were confirmed by CLSM. IONPs-CS-CHX39-FLZ156, IONPs-CS-CHX78-FLZ312, and CHX156-FLZ624 showed similar antibiofilm effects. The dual nanocarrier also significantly reduced LA production and the amount of carbohydrates and nucleic acids from the EM. A dose-dependent cytotoxic effect against oral keratinocytes was observed for the dual nanocarrier, regardless of the exposure period tested (24 or 48 h). IONPs-CSCHX-FLZ and CHX-FLZ significantly reduced keratinocyte viability at CHX and FLZ concentrations equal to or greater than 7.8 and 31.25 µg/mL, respectively. In conclusion, the nanotherapy tested in the current study is promising and constitutes a major advance in alternative methods to traditional antimicrobials for oral candidiasis control(AU)

Aspectos físicos e biológicos de nanopartículas de ferritas magnéticas / Physical and biological aspects of ferrite magnetic nanoparticles

Nanopartículas de óxidos magnéticos são compostas principalmente de Fe3O4 (magnetita) e Fe2O3 (maghemita), Também são muito utilizadas as de CoFe2O4 (ferrita de cobalto), NiFe2O4 (ferrita de níquel), entre outras, As nanopartículas de ferrita apresentam diversas aplicações na área biomédica, entre as quais a liberação controlada de fármacos, agentes de contraste para imagem de ressonância nuclear magnética, transportadores de fármacos guiados por campo magnético, tratamento de tumores via hipertermia, separação biomolecular magnética e diagnóstico, Para que as nanopartículas possam ser utilizadas devem possuir características magnéticas adequadas além de controle no tamanho e composição da superfície, Nesta revisão foi descrito um novo método de síntese e caracterização de nanopartículas de óxidos magnéticos os quais podem ser usados em aplicações biomédicas...

Nanoparticles of magnetic oxides are mainly composed of Fe3O4 (magnetite) and Fe2O3 (maghemite). However, CoFe2O4 (cobalt ferrite) and NiFe2O4 (Niguel ferrite), among others, are highly used. These ferrite nanoparticles show many biomedical applications, among them the controlled drug-release, contrast agents for magnetic resonance imaging, magnetic guided drug carriers to tumors treatment by hyperthermia, magnetic biomolecular separation and diagnostics. For these nanoparticles can be used, it should present adequate magnetic characteristics as well as controlled particle size and surface composition. In this review it was described a new method of synthesis and characterization of nanoparticles, as well as magnetic behavior and biomedical applications of nanoparticles...

Transferencia génica asistida por campos magnéticos: Estudios en células gliales / Magnetic field-assisted gene transfer: Studies in glial cells / Transferência gênica assistida por camposmagnéticos: Estudos em células gliais

Las nanopartículas magnéticas (MNP) complejadas con vectores génicos pueden, en presencia de un campo magnético externo, amplificar sustancialmente la eficiencia de la transferencia génica. Esta técnica, denominada magnetofección, es de gran interés en el campo de la terapia génica. En este estudio se caracterizó la mejora de transferencia génica en células gliales B92 utilizando complejos constituidos por diferentes proporciones de MNP asociadas a dos vectores adenovirales, a saber: los complejos entre las MNP denominadas PEI-Mag2 asociadas al adenovector RAd-GFP que expresa la proteína fluorescente verde GFP o al adenovector RAd-DsRed que expresa la proteína fluorescente roja DsRed2. Se demostró que para ambos vectores, a medida que la relación MNP/partícula viral física (PVF) va aumentando, la amplificación de la transfección también aumenta hasta que se llega a una relación MNP/PVF a partir de la cual el factor de amplificación alcanza un plateau. Se determinó que para el complejo PEI-Mag2/RAd-GFP la relación a partir de la cual se alcanza el plateau es de aproximadamente 0,5 fg Fe/PVF mientras que para el complejo PEI-Mag2/RAd-DsRed, esta relación corresponde a aproximadamente 71 fg Fe/PVF. Se concluye que los dos complejos magnéticos estudiados representan promisorias herramientas para mejorar la eficiencia en la terapia génica en células cerebrales.

It is known that certain types of magnetic nanoparticles (MNPs) complexed to gene vectors can, in the presence of an external magnetic field, greatly enhance gene transfer into cells. This technique, called magnetofection, is of great relevance to gene therapy. In the present study the ability of MNP/adenovector complexes to enhance gene transfer to B92 glial cells was assessed. Two complexes were assessed, namely PEI-Mag2/RAd-GFP and PEI-Mag2/RAd-DsRed, which are constituted by the MNP PEI-Mag2 complexed to the adenovector RAd-GFP (expressing the green fluorescent protein GFP) and RAd-DsRed (expressing the red fluorescent protein DsRed2), respectively. It was shown that for both vectors, an increase in the ratio MNP/PVP (physical viral particle) is paralleled by an increase in transduction efficiency, up to a certain threshold value at which an efficiency plateau is reached. This threshold value was 0.5 fg Fe/PVP for the RAd-GFP complex and about 71 fg Fe/PVP for the RAd-DsRed complex. It can be concluded that both magnetic complexes assessed in this study represent promising tools for enhancing the efficiency of gene therapy in brain cells.

As nanopartículas magnéticas (MNPs) complexadas com vetores de genes podem, em presença de um campo magnético externo, aumentar consideravelmente a eficiência da transferência gênica. Esta técnica, chamada magnetofecção, é de grande relevância para a terapia genética. No presente estudo, foi caracterizada a melhoria de transferência de genes em células gliais B92 utilizando complexos constituídos por diferentes proporções de MNP associadas a dois vetores adenovirais, a saber: os complexos entre as MNP denominadas PEI-Mag2 associadas ao adenovetor RAd-GFP que expressa a proteína fluorescente verde GFP ou ao adenovetor RAd-DsRed que expressa a proteína fluorescente vermelha DsRed2. Foi demonstrado que para ambos os vetores, enquanto a relação MNP/partícula viral física (PVF) vai aumentando, a amplificação da transfecção também aumenta até que se chega a uma relação MNP/PVF a partir da qual o fator de amplificação alcança um limiar. Determinou-se que para o complexo PEI-Mag2/RAd-GFP a relação a partir da qual se atinge o limiar é de aproximadamente 0,5 fg Fe/PVF ao passo que para o complexo PEI-Mag2/RAd-DsRed, esta relação corresponde a aproximadamente 71 fg Fe/PVF. Conclui-se que os dois complexos magnéticos estudados representam promissoras ferramentas para melhorar a eficiência na terapia de genes em células cerebrais.

Transferencia génica asistida por campos magnéticos: Estudios en células gliales / Magnetic field-assisted gene transfer: Studies in glial cells / TransferÛncia gÛnica assistida por camposmagnéticos: Estudos em células gliais

Las nanopartículas magnéticas (MNP) complejadas con vectores génicos pueden, en presencia de un campo magnético externo, amplificar sustancialmente la eficiencia de la transferencia génica. Esta técnica, denominada magnetofección, es de gran interés en el campo de la terapia génica. En este estudio se caracterizó la mejora de transferencia génica en células gliales B92 utilizando complejos constituidos por diferentes proporciones de MNP asociadas a dos vectores adenovirales, a saber: los complejos entre las MNP denominadas PEI-Mag2 asociadas al adenovector RAd-GFP que expresa la proteína fluorescente verde GFP o al adenovector RAd-DsRed que expresa la proteína fluorescente roja DsRed2. Se demostró que para ambos vectores, a medida que la relación MNP/partícula viral física (PVF) va aumentando, la amplificación de la transfección también aumenta hasta que se llega a una relación MNP/PVF a partir de la cual el factor de amplificación alcanza un plateau. Se determinó que para el complejo PEI-Mag2/RAd-GFP la relación a partir de la cual se alcanza el plateau es de aproximadamente 0,5 fg Fe/PVF mientras que para el complejo PEI-Mag2/RAd-DsRed, esta relación corresponde a aproximadamente 71 fg Fe/PVF. Se concluye que los dos complejos magnéticos estudiados representan promisorias herramientas para mejorar la eficiencia en la terapia génica en células cerebrales.(AU)

It is known that certain types of magnetic nanoparticles (MNPs) complexed to gene vectors can, in the presence of an external magnetic field, greatly enhance gene transfer into cells. This technique, called magnetofection, is of great relevance to gene therapy. In the present study the ability of MNP/adenovector complexes to enhance gene transfer to B92 glial cells was assessed. Two complexes were assessed, namely PEI-Mag2/RAd-GFP and PEI-Mag2/RAd-DsRed, which are constituted by the MNP PEI-Mag2 complexed to the adenovector RAd-GFP (expressing the green fluorescent protein GFP) and RAd-DsRed (expressing the red fluorescent protein DsRed2), respectively. It was shown that for both vectors, an increase in the ratio MNP/PVP (physical viral particle) is paralleled by an increase in transduction efficiency, up to a certain threshold value at which an efficiency plateau is reached. This threshold value was 0.5 fg Fe/PVP for the RAd-GFP complex and about 71 fg Fe/PVP for the RAd-DsRed complex. It can be concluded that both magnetic complexes assessed in this study represent promising tools for enhancing the efficiency of gene therapy in brain cells.(AU)

As nanopartículas magnéticas (MNPs) complexadas com vetores de genes podem, em presenþa de um campo magnético externo, aumentar consideravelmente a eficiÛncia da transferÛncia gÛnica. Esta técnica, chamada magnetofecþÒo, é de grande relevÔncia para a terapia genética. No presente estudo, foi caracterizada a melhoria de transferÛncia de genes em células gliais B92 utilizando complexos constituídos por diferentes proporþ§es de MNP associadas a dois vetores adenovirais, a saber: os complexos entre as MNP denominadas PEI-Mag2 associadas ao adenovetor RAd-GFP que expressa a proteína fluorescente verde GFP ou ao adenovetor RAd-DsRed que expressa a proteína fluorescente vermelha DsRed2. Foi demonstrado que para ambos os vetores, enquanto a relaþÒo MNP/partícula viral física (PVF) vai aumentando, a amplificaþÒo da transfecþÒo também aumenta até que se chega a uma relaþÒo MNP/PVF a partir da qual o fator de amplificaþÒo alcanþa um limiar. Determinou-se que para o complexo PEI-Mag2/RAd-GFP a relaþÒo a partir da qual se atinge o limiar é de aproximadamente 0,5 fg Fe/PVF ao passo que para o complexo PEI-Mag2/RAd-DsRed, esta relaþÒo corresponde a aproximadamente 71 fg Fe/PVF. Conclui-se que os dois complexos magnéticos estudados representam promissoras ferramentas para melhorar a eficiÛncia na terapia de genes em células cerebrais.(AU)

Nanomateriais magnéticos para aplicações em terapia e imagem / Magnetic nanomaterials for application in therapy and imaging

Em virtude da grande atenção que os nanomateriais magnéticos recebem atualmente, cientistas de diversas áreas (química, física, engenharia e medicina) vêm estudando as propriedades e as aplicações de nanopartículas magnéticas, gerando uma grande demanda por materiais de alta qualidade. As propriedades dos nanomateriais magnéticos são fortemente dependentes de suas propriedades intrínsecas (p. ex., composição, cristalinidade, tamanho e forma) e das interações entre as partículas, portanto sofrendo grande influencia do método de síntese aplicado. Várias técnicas para produção de nanomateriais magnéticos são conhecidas, porém muitas delas geram materiais com baixa qualidade no que diz respeito a tamanho médio e faixa de distribuição de tamanhos nas amostras. O presente trabalho teve por objetivo estudar a síntese de nanopartículas de magnetita (Fe3O4) por decomposição térmica do acetilacetonato de ferro (III), um método já conhecido e que se destaca pela alta qualidade de amostras (elevado controle no tamanho, estreita distribuição de tamanhos e forma bem definida), porém de alto custo. Estudamos a influência dos aditivos normalmente empregados no meio reacional no controle da morfologia, tamanho e polidispesão das amostras preparadas e sugerimos outros reagentes (monoóis, dióis e polióis) em busca de novas condições de síntese de nanopartículas magnéticas com morfologia e tamanho controlados. Do ponto de vista prático, reduzimos o custo de produção de nanomateriais magnéticos de alta qualidade pela utilização de aditivos mais baratos e de fácil obtenção no mercado. Os diferentes aditivos propostos modificaram as propriedades magnéticas ligadas às interações dipolares entre as partículas magnéticas. A influência dos aditivos foi testada em crescimentos sucessivos usando partículas de magnetita já formadas como sementes. O perfil de crescimento se mostrou diferente em função dos reagentes empregados e as amostras tiveram suas interações hiperfinas medidas para avaliar a relação entre o tamanho e aumento da cristalinidade das partículas formadas. O revestimento das partículas de magnetita com ouro foi estudado buscando aumentar a biocompatibilidade e proteger os núcleos magnéticos, porém as estruturas core-shell obtidas não apresentaram comportamento superparamagnético. Os estudos das interações hiperfinas mostraram perda da cristalinidade após o revestimento com ouro. As partículas de magnetita foram aplicadas para produzir calor através de hipertermia magnética, sendo que a interação entre as partículas se mostrou fundamental para o aumento do calor gerado. Outra aplicação biomédica testada foi o uso das partículas de magnetita como contraste para imagem por ressonância magnética nuclear. Nossas amostras mostraram desempenho semelhante às partículas disponíveis no mercado a alto custo

Magnetic nanomaterials have received a great deal of attention from scientists of various research fields (chemistry, physics, engineering and medicine) that have been studying the properties and applications of magnetic nanoparticles, generating a great demand for high quality materials. The magnetic properties of nanomaterials are strongly dependent on their intrinsic properties (eg., composition, crystallinity, size and shape) and the interactions between particles, therefore are influenced by the method of synthesis applied. Various techniques for the production of nanomarerials are known, but many of them produce poor quality materials, regarding to the average size, broad size distribution range and variable shape. The present work aimed to study the synthesis of magnetite nanoparticles (Fe3O4) by thermal decomposition of iron (III) acetylacetonate, a method already known for delivering high quality samples (high control on the size and narrow size distribution ), but at high cost. We studied the influence of additives normally used in the reaction medium to control the morphology, size and polydispersion and suggested other reagents (monols, diols and polyols) in the search for new conditions to synthesize magnetic nanoparticles with controlled size and morphology. From a practical viewpoint, we have reduced cost of producing high-quality magnetic nanoparticles using cheaper additives available on the market. The different additives used in the synthetic protocol modified the magnetic properties which are related to dipolar interactions between magnetic particles. The influence of additives was tested in successive growth using magnetite particles previously formed as seeds. The growth profile showed to be different depending on the additives used and the samples had their hyperfine interactions measured to estimate the relationship between the size increasing and the crystallinity of the particles formed. The coating of the magnetite particles with gold was studied in order to increase the biocompatibility and to protect the magnetic core. In this case, the core-shell structure lost the superparamagnetic behavior. Studies of hyperfine interactions showed the loss of crystallinity after coating the nanoparticles with gold. The synthesized particles were used to produce heat by magnetic hyperthermia, where the interaction between the particles proved to be crucial to increase the generated heat. Another biomedical application tested was the use of magnetite particles as contrast agent for magnetic resonance imaging. Our samples showed similar performance to the commercially available particles at high cost

The feasibility of using magnetic nanoparticles modified as gene vector / Viabilidad del uso de nanopartículas magnéticas modificadas como vectores genéticos

OBJECTIVE: To evaluate the feasibility of using magnetic nanoparticles (MNPs) as gene vector and the effect of magnetic field on efficiency of transfection. METHODS: Magnetic nanoparticles were prepared by controlling some chemical reaction parameters through a partially reduction precipitation method with ferric chloride aqueous solution as precursor material. The surface of particles was modified by polyethyleneimine (PEI) agents. The appearance, the size distribution, structure and phase constitute of MNPs were characterized by Transmission electron microscope (TEM), X-ray diffraction (XRD); the potential of absorbing DNA of MNPs was analysed by electrophoresis. Transfection was determined by delivering reporter gene, PGL2-control encoding luciferase, to different cell lines using MNPs-PLL as vector. The effect of magnetic field on the efficiency of transfection was determined using Nd-Fe-B permanent magnet. RESULTS: Foreign gene could be delivered to various cell lines by MNPs-PLL and expressed with high efficiency but the transfection efficiency and time course varied in the different cell lines studied. Magnetic field could enhance the efficiency of transfection by 5-10 fold. CONCLUSION: MNPs- PLL can be used as a novel non-viral gene vector in vitro, which offers a basis for gene delivery in vivo.

OBJETIVO: Evaluar la viabilidad del uso de nanopartículas magnéticas (MNPs) como vectores genéticos y el efecto de campo magnético en la eficiencia de la transfección. MÉTODOS: Se prepararon nanopartículas magnéticas mediante el control de algunos parámetros de la reacción química a través de un método de precipitación de reducción parcial con soluciones acuosas de cloruro férrico como el material precursor. La superficie de las partículas fue modificada mediante agentes de polietileneimina (PEI). La apariencia, el tamaño, distribución, estructura y constitución de fase de las MNPs, se caracterizaron mediante el microscopio electrónico de transmisión (MET), difracción de rayos X (DRX); el potencial de adsorber ADN de las MNPs se analizó mediante electroforesis; la transfección se determinó mediante el suministro del gene reportador de la luciferasa control PGL2, a diferentes líneas celulares usando MNPs - PLL como vectores. El efecto de campo magnético sobre la eficacia de la transfección se determinó usando el imán permanente NdFeB. RESULTADOS: El gene foráneo pudo suministrarse a varias líneas celulares mediante MNPs - PLL y expresarse con alta eficiencia pero la eficiencia de la transfección y el curso de tiempo variaron en las diferentes líneas celulares estudiadas. El campo magnético pudo mejorar la eficiencia de la transfección en 5-10 veces. CONCLUSION: Las MNPs - PLL pueden usarse como un nuevo vector genético no viral in vito, lo cual ofrece una base para el suministro del gene in vivo.