Tumor markers expression levels in gastric cancer patient's peripheral blood by rt-pcr assessment / Avaliação por rt-pcr de expressão de marcadores tumorais em sangue periférico de pacientes com câncer gástrico

ABSTRACT BACKGROUND: Hematological recurrence is the second most frequent cause of failure in the treatment of gastric cancer. The detection of circulating tumor markers in peripheral blood by quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (qRT-PCR) method may be a useful tool to predict recurrence and determine the patient's prognosis. However, no consensus has been reached regarding the association between the tumor markers level in peripheral blood and its impact on patient survival. AIMS: To evaluate the expression of the circulating tumor markers CK20 and MUC1 in peripheral blood samples from patients with gastric cancer by qRT-PCR, and to verify the association of their expression levels with clinicopathological characteristics and survival. METHODS: A total of 31 patients with gastric adenocarcinoma were prospectively included in this study. CK20 and MUC1 expression levels were analyzed from peripheral blood by the qRT-PCR technique. RESULTS: There was no statistically significant (p>0.05) association between CK20 expression levels and clinical, pathological, and surgical features. Higher MUC1 expression levels were associated with female patients (p=0.01). There was a correlation between both gene levels (R=0.81, p<0.001), and CK20 level and tumor size (R=0.39, p=0.034). CONCLUSIONS: CK20 and MUC1 expression levels could be assessed by qRT-PCR from total peripheral blood samples of patients with gastric cancer. CK20 levels were correlated to MUC1 levels as well as to tumor size. There was no difference in disease-free survival and overall survival regarding both genetic markers expression in this series.

RESUMO RACIONAL: A recorrência hematológica é a segunda causa mais frequente de falha no tratamento do câncer gástrico. A detecção de marcadores tumorais circulantes no sangue periférico, pelo método de reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa quantitativa (qRT-PCR) pode ser uma ferramenta útil para prever a recorrência e determinar o prognóstico do paciente. No entanto, ainda não foi alcançado consenso em relação à associação entre o nível de marcadores tumorais circulantes no sangue periférico e seu impacto na sobrevida do paciente. OBJETIVOS: Avaliar a expressão de CK20 e MUC1 em amostras de sangue periférico de pacientes com câncer gástrico por meio de qRT-PCR e verificar a associação dos níveis de expressão com características clinicopatológicas e sobrevida. MÉTODOS: Trinta e um pacientes com adenocarcinoma gástrico foram incluídos, prospectivamente. Os níveis de expressão de CK20 e MUC1 foram analisados a partir de sangue periférico por meio de qRT-PCR. RESULTADOS: Não houve associação estatisticamente significativa (p>0,05) entre os níveis de expressão de CK20 com características clínicas, patológicas e cirúrgicas. Níveis mais elevados de expressão de MUC1 estavam associados a pacientes do sexo feminino (p=0,01). Houve correlação entre os níveis de ambos os genes (R=0,81, p<0,001), nível de CK20 e tamanho do tumor (R=0,39, p=0,034). CONCLUSÕES: Os níveis de CK20 e MUC1 podem ser avaliados por qRT-PCR a partir de amostras de sangue periférico total de pacientes com câncer gástrico, os níveis de CK20 estavam correlacionados com os de MUC1, assim como tamanho do tumor. Não houve diferença de sobrevida global ou livre de doença em relação à expressão de ambos marcadores genéticos nesta série.

Troponina de alta sensibilidade no prognóstico de pacientes internados em terapia intensiva por COVID-19: um estudo de coorte longitudinal latino-americano / High-sensitivity troponin in the prognosis of patients hospitalized in intensive care for COVID-19: a Latin American longitudinal cohort study

RESUMO Objetivo: O presente estudo avaliou a prevalência da elevação da troponina e sua capacidade de prever a mortalidade em 60 dias em pacientes com COVID-19 internados em unidade de terapia intensiva. Metódos: Um estudo longitudinal prospectivo e unicêntrico foi realizado em uma coorte de pacientes em terapia intensiva devido a diagnóstico de COVID-19 confirmado, usando teste de reação em cadeia da polimerase em tempo real de maio a dezembro de 2020. Uma curva Característica de Operação do Receptor foi construída para predizer o óbito de acordo com o nível de troponina, calculando a área sob a curva e seus intervalos de confiança. Um modelo de risco proporcional de Cox foi gerado para relatar as razões de risco com intervalo de confiança de 95% e o valor de p para sua associação com mortalidade em 60 dias. Resultados: Foram incluídos 296 pacientes com taxa de mortalidade em 60 dias de 51%. A troponina foi positiva em 39,9% (29,6% versus 49,7% em sobreviventes e não sobreviventes, respectivamente). Foi encontrada área sob a curva de 0,65 (IC95% 0,59 - 0,71) para prever a mortalidade. O modelo univariado de Cox demonstrou razão de risco de 1,94 (IC95% 1,41 - 2,67) e p < 0,001, mas essa relação não se manteve no modelo de análise multivariado, no qual a razão de risco foi de 1,387 (IC95% 0,21 - 1,56) e o valor de p foi de 0,12. Conclusão: A elevação da troponina é frequentemente encontrada em pacientes em terapia intensiva para COVID-19. Embora seus níveis sejam maiores em pacientes que vão a óbito, nenhuma relação foi encontrada em um modelo de análise multivariado, o que indica que a troponina não deve ser utilizada como único marcador prognóstico de mortalidade nessa população.

ABSTRACT Objective: The current study assessed the prevalence of troponin elevation and its capacity to predict 60day mortality in COVID-19 patients in intensive care. Methods: A longitudinal prospective single-center study was performed on a cohort of patients in intensive care due to a COVID-19 diagnosis confirmed using real-time test polymerase chain reaction from May to December 2020. A Receiver Operating Characteristic curve was constructed to predict death according to troponin level by calculating the area under the curve and its confidence intervals. A Cox proportional hazards model was generated to report the hazard ratios with confidence intervals of 95% and the p value for its association with 60day mortality. Results: A total of 296 patients were included with a 51% 60-day mortality rate. Troponin was positive in 39.9% (29.6% versus 49.7% in survivors and non-survivors, respectively). An area under the curve of 0.65 was found (95%CI: 0.59 - 0.71) to predict mortality. The Cox univariate model demonstrated a hazard ratio of 1.94 (95%CI: 1.41 - 2.67) and p < 0.001, but this relationship did not remain in the multivariate model, in which the hazard ratio was 1.387 (95%CI: 0.21 - 1.56) and the p value was 0.12. Conclusion: Troponin elevation is frequently found in patients in intensive care for COVID-19. Although its levels are higher in patients who die, no relationship was found in a multivariate model, which indicates that troponin should not be used as an only prognostic marker for mortality in this population.

Chest computed tomography in the diagnosis of COVID-19 in patients with false negative RT-PCR / Tomografia computadorizada de tórax no diagnóstico de COVID-19 em pacientes com resultado falso-negativo na RT-PCR

ABSTRACT Objective To evaluate the role of chest computed tomography in patients with COVID-19 who presented initial negative result in reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). Methods A single-center, retrospective study that evaluated 39 patients with negative RT-PCR for COVID-19, who underwent chest computed tomography and had a final clinical or serological diagnosis of COVID-19. The visual tomographic classification was evaluated according to the Consensus of the Radiological Society of North America and software developed with artificial intelligence for automatic detection of findings and chance estimation of COVID-19. Results In the visual tomographic analysis, only one of them (3%) presented computed tomography classified as negative, 69% were classified as typical and 28% as indeterminate. In the evaluation using the software, only four (about 10%) had a probability of COVID-19 <25%. Conclusion Computed tomography can play an important role in management of suspected cases of COVID-19 with initial negative results in RT-PCR, especially considering those patients outside the ideal window for sample collection for RT-PCR.

RESUMO Objetivo Avaliar o papel da tomografia computadorizada de tórax em pacientes com COVID-19 que apresentaram reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa (RT-PCR) inicial falsamente negativa. Métodos Estudo retrospectivo de centro único que avaliou 39 pacientes com RT-PCR negativa para COVID-19, submetidos à tomografia computadorizada de tórax e que tiveram diagnóstico final clínico ou serológico de COVID-19. A classificação tomográfica visual foi avaliada de acordo com o Consenso da Radiological Society of North America e o software desenvolvido com inteligência artificial para detecção automática de achados e estimativa de probabilidade de COVID-19. Resultados Na análise tomográfica visual, somente um deles (3%) apresentou tomografia computadorizada classificada como tendo resultado negativo, 69% foram classificados como típicos e 28% como indeterminados. Na avaliação com uso de software, somente quatro (cerca de 10%) tiveram probabilidade de COVID-19 <25%. Conclusão A tomografia computadorizada pode desempenhar papel importante no manejo de casos suspeitos de COVID-19 com RT-PCR inicialmente negativa, principalmente levando-se em consideração os pacientes que estão fora da janela ideal para coleta de amostra para RT-PCR.

COVID-19: clinical and laboratory manifestations in novel coronavirus infection / COVID-19: manifestações clínicas e laboratoriais na infecção pelo novo coronavírus

ABSTRACT COVID-19 is a highly contagious disease caused by the coronavirus of severe acute respiratory syndrome 2 (SARS-CoV-2). In 2020, due to the outbreak, it was considered by the World Health Organization (WHO) as a pandemic. The infection caused by the novel coronavirus has high mortality in a small portion of the infected population, especially in elderly, immunosuppressed, diabetic, cardiac, and hypertensive individuals. Many infected are asymptomatic (and may be carriers) or present mild or moderate flu-like symptoms. The most severe clinical picture of COVID-19 is characterized by an inflammatory cytokine storm, with hematological changes and coagulation dysfunction, which can lead to tissue damage and death. Nonspecific laboratory biomarkers may be either increased or decreased as the course of the disease progresses and are often useful in predicting complications of the disease, such as the use of D-dimer and platelet/lymphocyte ratio. Specific laboratory diagnosis is based on the detection of viral ribonucleic acid (RNA) by real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) of nasal and oropharyngeal swab samples; it is more effective when performed in the first days after symptom onset. Serological tests are useful in detecting the immune response, since both class M (IgM) and class G (IgG) immunoglobulin antibodies can be detected seven days after the onset of clinical symptoms, and may extend for more than 25 days, although not exempting the individual from remaining infectious, depending on their viral load and clinical presentation. The rational use of specific laboratory markers must respect the disease chronology, and the correct interpretation may provide subsidies for a better management of affected patients, as well as identifying asymptomatic carriers or those with mild symptoms.

RESUMEN La COVID-19 es una enfermedad altamente contagiosa causada por el coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV-2). En 2002, a causa del brote, fue reconocida como una pandemia por la Organización Mundial de la Salud (OMS). La infección por el nuevo coronavirus provoca alta mortalidad en una pequeña parcela de la población infectada, especialmente en ancianos, pacientes inmunodeprimidos, diabéticos, cardiópatas e hipertensos. Muchos infectados son asintomáticos (y pueden ser portadores) o presentan síntomas leves a moderados, como en un estado gripal. El cuadro clínico de la COVID-19 en la forma más grave es caracterizado por una tormenta inflamatoria de citoquinas, con cambios hematológicos y de la coagulación que pueden llevar a daño tisular y muerte. Pruebas de laboratorio inespecíficas pueden presentar tasas más altas o bajas según el curso de la enfermedad, y muchas veces son útiles en la predicción de complicaciones, como el uso del dímero D y la ratio plaquetas/linfocitos. El diagnóstico de laboratorio específico se basa en la detección del ácido ribonucleico (ARN) viral por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real de muestras de hisopado nasal y orofaríngeo; es más efectiva en los primeros días tras el inicio de los síntomas. Pruebas serológicas son útiles para detectar la respuesta inmune, pues tanto los anticuerpos de la inmunoglobulina M (IgM) como de la G (IgG) pueden se detectar siete días después del inicio de los síntomas clínicos, y pueden permanecer por más de 25 días, aunque no eximen al individuo de seguir infeccioso, dependiendo de su carga viral y presentación clínica. El uso racional de los marcadores de laboratorio específicos debe respetar la cronología de la enfermedad, y la interpretación correcta puede proporcionar recursos para un mejor manejo de los pacientes afectados, así como identificar portadores asintomáticos o con pocos síntomas.

RESUMO COVID-19 é uma doença altamente contagiosa provocada pelo coronavírus da síndrome respiratória aguda grave 2 (SARS-CoV-2). Em 2020, devido ao surto, foi caracterizada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) como pandemia. A infecção causada pelo novo coronavírus tem alta mortalidade em uma pequena parcela da população infectada, especialmente em indivíduos idosos, imunodeprimidos, diabéticos, cardiopatas e hipertensos. Muitos infectados são assintomáticos (e podem ser portadores) ou apresentam sintomas leves a moderados, semelhantes ao estado gripal. O quadro clínico da COVID-19 na forma mais severa é caracterizado por uma tempestade inflamatória de citocinas, com alterações hematológicas e da coagulação que podem levar ao dano tecidual e morte. Exames laboratoriais inespecíficos podem apresentar-se mais elevados ou diminuídos conforme o curso da doença, e muitas vezes são úteis na predição de complicações, como o uso do D-dímero e a razão plaqueta/linfócitos. O diagnóstico laboratorial específico se baseia na detecção do ácido ribonucleico (RNA) viral por reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR) de amostras de suabe nasal e orofaríngeo; é mais efetivo nos primeiros dias após o início dos sintomas. Testes sorológicos são úteis na detecção da resposta imune, pois tanto os anticorpos da imunoglobulina da classe M (IgM) quanto da classe G (IgG) podem ser detectados após sete dias do início dos sintomas clínicos, podendo se estender por mais de 25 dias, embora não isente o indivíduo de continuar infectante, dependendo de sua carga viral e apresentação clínica. O uso racional dos marcadores laboratoriais específicos deve respeitar a cronologia da doença, e a interpretação correta pode fornecer subsídios para um melhor manejo dos pacientes acometidos, bem como identificar portadores assintomáticos ou com pouco sintomas.

Red blood cells in cerebrospinal fluid as possible inhibitory factor for enterovirus RT-PCR / Presença de hemácias no líquido cefalorraquidiano como possível fator inibitório da RT-PCR para detecção de enterovirus

ABSTRACT The presence of hemoglobin in samples are considered an important inhibitory factor for polymerase chain reaction (PCR). The aim of this study was to examine the influence of red blood cells (RBC)s in cerebrospinal fluid (CSF) as an inhibitory factor to reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) for enteroviruses (EV). Forty-four CSF samples from patients showing characteristics of viral meningitis were assessed for EV by RT-PCR. Viral RNA extracted with guanidine isothyocianate buffer and virus detection was performed by in-house nested PCR. Positivity for EV RT-PCR was higher in CSF samples without RBCs than in samples with RBCs: 13(26%) and 36(9.2%), p = 0.001. In the group with positive EV RT-PCR, the mean + SD CSF RBC was 37 ± 183 cell/mm3; the group with negative results had 580 + 2,890 cell/mm3 (p = 0.007). The acceptable upper limit for CSF RBCs that could not influence RT-PCR was 108 cells/mm3. CSF samples with negative results for EV RT-PCR have more erythrocytes.

RESUMO A presença de hemoglobina em amostras de fluidos corporais é considerada um fator inibitório importante da reação em cadeia da polimerase (PCR). O objetivo deste estudo era examinar a influencia de hemácias no líquido cefalorraquidiano (LCR) como um fator inibitório da RT-PCR para enterovirus (EV). Quatrocentos e quarenta amostras de LCR de pacientes com características de meningite viral foram avaliados para enterovirus por RT-PCR. RNA viral foi extraído com tampão de isotiocianato de guanidina e a detecção viral foi feita com nested PCR in-house. A positividade do EV RT-PCR no LCR foi maior nas amostras de LCR sem hemácias do que as amostras com hemácias: 13 (26%) e 36 (9,2%), respectivamente (p = 0,001). No grupo com resultados EV RT-PCR positivo, a media ± DP do número de hemácias no LCR foi 37 ± 183 cell/mm3 e no grupo com resultados negativos foi 580 ± 2.890 cell/mm3 (p = 0,007). O limite superior aceitável de hemácias no LCR para não inibir o resultado do PCR foi 108 cells/mm3. As amostras de LCR com resultados negativos para RT-PCR EV tem mais eritrócitos em comparação com amostras com resultados positivos.

Estudo da viabilidade para introduzir na rotina testes de diagnóstico para infecção respiratória aguda / Feasibility study to introduce the routine diagnostic tests for acute respiratory infection

Para avaliar os benefícios da comunicação rápida ao clínico do diagnóstico de vírus respiratórios, foi analisado a viabilidade econômica de 2 testes, com o tempo de entrega de resultado em 2 horas para teste rápido e 48 horas para Biologia Molecular. As amostras coletadas foram processadas utilizando técnicas convencionais e os testes disponíveis no mercado local. Foram escolhidos dois testes rápidos pelo método de imunocromatografia para quatro parâmetros analíticos: Influenza A, Influenza H1N1, Influenza B e Vírus Sincicial Respiratório (RSV) e em Biologia Molecular um teste de RT-PCR multiplex com 25 patógenos entre vírus e bactérias. O tipo de amostra utilizada foi swab e lavado de nasofaringe. A população escolhida para o estudo foi paciente adulto, em tratamento de câncer, que necessita de uma resposta rápida já que a maioria se encontra com comprometimento do sistema imune por doença ou por tratamento. O estudo foi transversal, realizado entre os anos de 2012 e 2013, para avaliar a viabilidade econômica da introdução de testes de diagnóstico da infecção respiratória aguda de etiologia viral a partir de amostras de nasofaringe em pacientes com câncer atendidos no Centro de Atendimento de Oncologia Intercorrência (CAIO ), do Instituto do Câncer do Estado de São Paulo (ICESP), hospital público que atende exclusivamente Sistema Único de Saúde (SUS) e Hospital A.C. Camargo, que atende tanto a pacientes do SUS como da rede privada. O estudo incluiu 152 pacientes em tratamento para qualquer tipo de câncer, predominantemente do sexo feminino (81 mulheres e 70 homens) com idades entre 18-86 anos. Para participar do estudo o paciente era consultado e o critério para escolha do paciente foi ser portador de câncer, com história de febre (ainda que referida) acompanhada de tosse ou dor de garganta, tosse e sintomas respiratórios agudos, atendidos por protocolo padronizado que inclui avaliação na admissão, seguimento e manejo antimicrobiano. Para a...

To evaluate the benefits of the rapid communication of the respiratory viruses' diagnosis to the doctor, the economic feasibility of two tests was analyzed, with the result delivery time within 2-hours for the rapid test and 48 hours for Molecular Biology. The samples were processed using conventional techniques and the available tests in the local market. Two rapid tests were selected by the immunochromatography method for four analytical parameters: Influenza A, Influenza A H1N1, Influenza B, and Respiratory Syncytial Virus (RSV) and in Molecular Biology a multiplex RT-PCR assay with 25 pathogens between viruses and bacteria. The type of sample used was swab and nasopharyngeal wash. The population chosen for the study was of adult patients undergoing cancer treatment, which requires a rapid response since most have a compromised immune system due to the disease or treatment. The study, conducted between 2012 and 2013, was cross-sectional to evaluate the economic feasibility of introducing diagnostic tests for acute respiratory infection of viral etiology from nasopharyngeal samples of patients with cancer attended at the Oncology Intercurrence Care Center (CAIO), at the Cancer Institute of the São Paulo State (ICESP), at public hospital that attends exclusively the Unified Health System (SUS) and at AC Camargo hospital, which attends SUS patients as well as the private health system. The study included 152 patients undergoing treatment for any type of cancer, predominantly female (81 women and 70 men) between 18 and 86 years. To participate in the study, the patients were consulted and the criteria for choosing a patient was to be a cancer patient with a history of fever (even if referred) accompanied by cough or sore throat, coughing and acute respiratory symptoms, attended by standardized protocol that includes an evaluation at the admission, tracking and antimicrobial management. For the economic evaluation, patients were classified according to the...

MammaGene: ensaio quantitativo de 21 genes para prognóstico do câncer de mama receptor de estrogênio positivo / MammaGene®: a quantitative 21-gene assay for prognostic of breast cancer estrogen receptor-positive

Objetivos: Padronizar em nosso meio um ensaio que analisa, por RT-PCR, 21 genes e descrever a experiência inicial com 95 casos consecutivos de carcinoma inicial de mama receptor de estrogênio positivo. Métodos: O teste foi desenvolvido a partir dos relatos publicados por Cronin et al. (2004) e Paik et al. (2004) para a avaliação da expressão de genes em tecido fixado em formalina e incluído em parafina. O teste foi aplicado em uma coorte consecutiva de 95 amostras de câncer de mama receptor de estrogênio positivo e os escores finais foram comparados com a idade da paciente, O tamanho do tumor, o tipo e o grau histológico, expressão imunoistoquímica do receptor de estrogênio, índice de Ki67 e subtipo molecular. Resultados: Os escores finais variaram de 3 a 90 e as categorias de risco de recorrência em dez anos foram: baixa (34 casos), intermediária (38 casos) e alta (23 casos). Não houve associação das categorias de risco com idade, comprometimento linfonodal e tipo histológico. A media do tamanho dos tumores foi maior no grupo de alto escore (2,0 versus 1,2 cm). Observou-se associação entre o escore obtido pelo teste e grau histológico, Ki-67, nível de expressão de receptor de estrogênio e subtipo molecular. Conclusão: A realização do teste de 21 genes foi factível em nosso meio. Alem disso, os dados preliminares, aliados aos dados da literatura, sugerem que tal teste pode ser uma ferramenta útil na avaliação do risco de recorrência a distância em câncer de mama receptor de estrogênio positivo. No entanto, estudos adicionais são necessários para comparar os resultados deste trabalho com séries amplas publicadas na literatura.

Objectives: To standardize a homemade RT-PCR-based 21-gene assay and to describe the preliminary experience with 95 early positive estrogen receptor breast cancer consecutive cases. Methods: The test was developed using the reports described by Cronin et al. (2004) and Paik et al. (2004) for the evaluation of gene expression in fixed, paraffin-embedded tumor tissue. The test was performed in a consecutive cohort of 95 positive estrogen receptor breast carcinomas, and the final scores were compared with the patient's age, tumor size, histological type, histological degree, estrogen receptor immunohistochemical expression, Ki-67 expression, and molecular luminal subtype. Results: Final scores ranged from 3 to 90 and risk categories of recurrence in ten years were: low (34 cases), intermediate (38 cases), and high (23 cases). There was no association between score categorical distribution and age, lymph node status, or histological type. Mean tumor size was higher in the high score group (2.0 versus 1.2 cm). We have observed an overall concordance between the score obtained by the test, and the histological degree, Ki-67, estrogen receptor level, and molecular subtype. Conclusion: The developed 21-gene assay is a feasible test to be performed in a homemade setting. Besides, the preliminary data from this study suggest, in comparison with data from the literature, that this test has the potential to be a useful tool to evaluate the risk of breast cancer distant recurrence. However, further data are necessary in order to compare this paper's results with larger series published in the literature.

Avaliação da excreção genital do HIV-1 em mulheres menopausadas e em idade fértil: prevalência e fatores associados / HIV cervicovaginal shedding among postmenopausal and fertile-aged women: prevalence and associated factors

INTRODUÇÃO: Poucos estudos têm focado as modificações fisiológicas que ocorrem no trato genital de mulheres menopausadas infectadas pelo HIV e sua associação com a excreção genital do vírus. Nesse estudo de corte transversal, comparou-se a excreção genital do HIV em mulheres menopausadas e em idade fértil em acompanhamento em um centro especializado em São Paulo, Brasil. Investigou-se também a associação entre a excreção genital de RNA de HIV e a viremia em ambos os grupos. Fatores associados com a intensidade da excreção genital de HIV também foram pesquisados, incluindo achados ginecológicos e marcadores de progressão da infecção por HIV. MÉTODOS: 146 mulheres infectadas pelo HIV [73 menopausadas (M)/73 em idade fértil (F)] foram selecionadas em Serviço de Extensão ao Atendimento de Pacientes com HIV/Aids Casa da Aids do Hospital das Clínicas da FMUSP, São Paulo, Brasil. As mulheres menopausadas referiram tempo médio de 8,17 anos (DP=6 anos) de menopausa. A contagem de linfócitos T CD4+ foi obtida por citometria de fluxo e a quantificação do RNA do HIV no plasma e no lavado cervicovaginal (LCV) foi realizada por RT-PCR quantitativo, utilizando-se o kit Cobas Amplicor HIV-1 Monitor Test®, no método ultrasensível. Cloreto de lítio foi introduzido no tampão para obtenção do LCV e quantificado antes e depois da coleta do lavado, a fim de determinar o fator de diluição de cada amostra. A deteção do gene SRY por PCR também foi realizada a fim de eliminar amostras com eventual contaminação espermática. A prevalência de excreção genital foi estimada para ambos os grupos e os fatores associados à intensidade da excreção viral foram investigados, utilizando-se modelo de regressão linear múltipla. As variáveis com p<0,2 na análise bivariada foram incluídas na análise multivariada, assim como o grupo em estudo (M ou F). O modelo final incluiu fatores que se mostraram independentemente associados com a intensidade da excreção genital de HIV...

BACKGROUND: Few studies have focused on physiological modifications that occur in the genital tract of HIV-infected postmenopausal women and their association with HIV cervicovaginal shedding. In this cross-sectional study we evaluated and compared HIV genital shedding among postmenopausal and fertile-aged women under care at a specialized center in Sao Paulo, Brazil, investigating the association between HIV-RNA shedding and HIV plasma viral loads in both groups. Factors associated with higher HIV shedding were also investigated, including gynaecological features and HIV disease progression markers. METHODS: 146 women living with HIV [73 postmenopausal (PM)/73 in fertile-aged (F)] were enrolled at the HIV Clinic, University of São Paulo Medical School, Brazil. Postmenopausal women referred a mean duration of 8.17y (SD=6y) since menopause. CD4+ cell counts were obtained by flow cytometry and HIV-RNA was quantified in plasma and in cervicovaginal lavages (CVL) by RT-PCR, using Cobas Amplicor HIV-1 Monitor Ultrasensitive Test. Lithium chloride was introduced into the CVL buffer and measured before and after CVL collection in order to determine the dilution factor for each specimen. SRY gene detection by PCR was also performed in all samples in order to rule out sperm contamination. Prevalence of HIV genital shedding was estimated for both groups and factors associated with the intensity of viral shedding were investigated, using a multiple linear regression model. Variables with p<0.2 in bivariate analysis were included in multivariate analysis, as well as the study group (PM and F). The final model included factors shown to be independently associated with intensity of HIV genital shedding. RESULTS: The prevalence of HIV-RNA genital shedding was similar in both groups. (PM: 17.8%, 95%CI 9.8 28.5; F: 22%, 95%CI 13.1 33.1, p=0.678). Likewise, the intensity of HIV shedding was shown not to differ between PM and F women...

Expression of MRP1 gene in acute leukemia / Expressão do gene MRP1 em leucemias agudas

CONTEXT AND OBJECTIVE: Overexpression of the multidrug resistance-associated protein 1 (MRP1) gene has been linked with resistance to chemotherapy in vitro, but little is known about its clinical impact on acute leukemia patients. Our aim was to investigate the possible association between MRP1 gene expression level and clinical outcomes among Iranian leukemia patients. DESIGN AND SETTING: This was an analytical cross-sectional study on patients referred to the Hematology, Oncology and Stem Cell Research Center, Sharyatee Public Hospital, whose diagnosis was acute myelogenous leukemia (AML) or acute lymphoblastic leukemia (ALL). All molecular work was performed at NIGEB (public institution). METHODS: To correlate with prognostic markers and the clinical outcome of acute leukemia, MRP1 gene expression was assessed in 35 AML cases and 17 ALL cases, using the quantitative real-time polymerase chain reaction and comparing this to the chemotherapy response type. RESULTS: Mean expression in AML patients in complete remission (0.032 ± 0.031) was significantly lower than in relapsed cases (0.422 ± 0.297). In contrast, no significant difference in MRP1 mRNA level was observed between complete remission and relapsed ALL patients. There was a difference in MRP1 expression between patients with unfavorable and favorable cytogenetic prognosis (0.670 ± 0.074 and 0.028 ± 0.013, respectively). MRP1 expression in M5 was significantly higher (p-value = 0.001) than in other subtypes. CONCLUSIONS: The findings suggest that high MRP1 expression was associated with poor clinical outcome and was correlated with the M5 subtype and poor cytogenetic subgroups among AML patients but not among ALL patients.

CONTEXTO E OBJETIVO: A superexpressão do gene de resistência a múltiplas drogas associado à proteína 1 (MRP1) tem sido ligada à resistência à quimioterapia in vitro, porém pouco é conhecido sobre seu impacto clínico nos pacientes com leucemia aguda. Nosso objetivo foi investigar a possível associação entre a expressão do gene MRP1 e os desfechos clínicos em pacientes iranianos com leucemia. DESENHO E LOCAL: Este foi um estudo analítico transversal em pacientes encaminhados ao Centro de Pesquisa em Hematologia, Oncologia e Células Tronco do Hospital Público de Sharyatee, com diagnóstico de leucemia mielóide aguda (LMA) ou leucemia linfoblástica aguda (LLA). Todo trabalho molecular foi realizado no NIGEB (instituição pública). MÉTODOS: Para correlação de marcadores prognósticos e desfechos clínicos da leucemia aguda, a expressão do MRP1 foi avaliada em 35 casos de LMA e 17 de LLA, usando a reação da cadeia de polimerase quantitativa em tempo real, e comparando este dado ao tipo de resposta à quimioterapia. RESULTADOS: A média da expressão em pacientes com LMA em remissão completa (0,032 ± 0,031) foi significativamente menor que aquela dos casos recidivantes (0,422 ± 0,297). Por outro lado, não foram observadas diferenças significativas nos níveis de mRNA para MRP1 entre os casos de LLA com remissão completa e os casos recidivantes. Houve uma diferença na expressão de MRP1 entre pacientes com prognóstico citogenético não-favorável e favorável (0,670 ± 0,074 e 0,028 ± 0,013, respectivamente). A expressão de MRP1 em M5 foi significativamente maior (valor de p = 0,001) do que em outros subtipos. CONCLUSÕES: Os achados sugerem que a alta expressão de MRP1 se associou com o pior desfecho clínico, estando correlacionada com o subtipo M5 e os subgrupos citogenéticos menos favoráveis para os pacientes com LMA, mas não para pacientes com LLA.

Pesquisa de células malignas circulantes em pacientes com melanoma maligno de coróide / Detection of circulating malignant cells in patients with uveal melanoma

OBJETIVO: Avaliar a possibilidade de identificação de células malignas circulantes nas amostras de sangue periférico de pacientes brasileiros com melanoma maligno de coróide enviadas para análise no exterior. MÉTODOS: Os marcadores melan-A e tirosinase foram usados para detectar a presença de células malignas circulantes, pela transcrição reversa seguida de reação em cadeia da polimerase e análise seqüencial de DNA (RT-nested-PCR), em seis pacientes com melanoma maligno de coróide, diagnosticados no Brasil. RESULTADOS: Cinco pacientes deste grupo (83,33 por cento) foram considerados positivos. A reação de RT-nested-PCR foi positiva para melan-A em quatro (66,7 por cento) e positiva para tirosinase em quatro (66,7 por cento) dos seis pacientes testados. Três (50 por cento) pacientes foram positivos para os dois marcadores. Um (16,7 por cento) paciente foi negativo para ambos marcadores. CONCLUSÃO: A pesquisa de células malignas circulantes usando RT-nested-PCR, foi positiva na maioria dos pacientes estudados. A qualidade das amostras de sangue periférico dos pacientes brasileiros foi mantida no material preservado mesmo após ter sido enviado ao exterior.

PURPOSE: The purpose of our study was to detect circulating malignant cells (CMCs) in oversea-shipped blood samples of patients with uveal melanoma diagnosed in Brazil. METHODOS: Melan-A and tyrosinase were the two markers used for the detection of CMCs, using reverse transcriptase nested polymerase chain reaction (RT-nested-PCR) in 6 patients with uveal melanoma. The expression of beta-actin and GAPDH were used to assess the quality of the material. RESULTS: Five patients (83.33 percent) tested positive for the presence of CMCs. The RT-nested-PCR was positive for melan-A in 4 patients (66.7 percent) and positive for tyrosinase in 4 (66.7 percent) of the 6 patients. Three (50 percent) patients were positive for both markers. One (16.7 percent) patient was negative for both markers. All negative controls were negative. CONCLUSION: The quality of the blood samples shipped overseas, from patients with uveal melanoma, was preserved. The detection of CMCs using RT-nested-PCR was positive in the majority of the patients.

Expressão do simportador sódio-iodo (NIS) nos tumores tireoidianos benignos e malignos através de estudo imunohistoquímico e da quantificação do RNA mensageiro / Expression of the sodium iodide symporter (NIS) in benign and malignant thyroid tumors using immunohistochemistry and mesenger RNA quantification

O transporte de iodo para tireóide é mediado pelo simportador sódio-iodo (NIS), glicoproteína de 643 aminoácidos localizada na região basolateral da célula folicular que acopla a entrada de sódio e iodo para o interior da célula. A clonagem do gene NIS em 1996 foi o primeiro passo na investigação dos mecanismos moleculares responsáveis pela diminuição da captação do radioiodo nos tumores benignos e malignos da tireóide. Estudos prévios sobre a expressão do gene NIS baseados em quantificação do transcrito e/ou análise imuno-histoquímica da proteína, mostraram resultados bastante divergentes. A maioria dos estudos com RT-PCR mostrou redução ou até ausência do transcrito do NIS. Os estudos mais recentes de imunohistoquímica, no entanto, mostraram aumento da expressão da proteína NIS, ao invés de diminuição. Poucos foram os estudos que fizeram análise do transcrito e da proteína concomitantemente nas mesmas amostras. Este estudo teve como objetivo quantificar o RNAm do gene NIS e avaliar a expressão e localização celular da proteína NIS, através das técnicas de RT-PCR em tempo real e exame imunohistoquímico, respectivamente. Foram estudadas 30 amostras de nódulos de tireóide, sendo 14 nódulos benignos e 16 nódulos malignos, sempre pareados com o tecido não-tumoral do mesmo paciente. Através de exame cintilográfico, verificou-se que 100% dos nódulos malignos e 85,7% dos benignos eram hipocaptantes. Houve diminuição da expressão gênica do NIS em 78,6% dos nódulos benignos, em 81,2% dos carcinomas utilizando o gene PSMC6 como controle interno e em 100% dos carcinomas com o gene GAPDH como controle interno. O exame imunohistoquímico da proteína NIS revelou positividade da proteína NIS no citoplasma em 100% dos tecidos não-tumorais, 100% dos nódulos benignos e 93,75% dos nódulos malignos, não sendo estatisticamente diferentes entre si. A positividade na membrana basolateral ocorreu em 23,3% das amostras não-tumorais, em 14,3%...

The iodide uptake by epithelial thyroid cells requires the expression of sodium iodide symporter (NIS), a transmembrane glycoprotein of 643 amino acids. NIS is located at basolateral plasma membrane of the thyroid follicular cells and couples the transport of iodide and sodium to this cells. NIS gene was cloned in 1996, being the first step of investigation of the mechanisms responsible for the lower uptake of radioiodide by benign and malignant thyroid tumors. Previous studies about expression of NIS gene based in quantification by RT-PCR and/or immunohistochemistry analysis showed divergent data. The majority of RT-PCR studies showed reduction or even absence of transcript of NIS in malignant tumors. Recent studies of immunostaining showed that many tumors overexpress rather than under express NIS. Only a few studies have made the analysis of the transcript and the protein at the same time in the same samples. The objective of this study was to investigate NIS transcript levels and the presence and location of NIS protein, using real time RT-PCR and immunohistochemistry, respectively. It was included 30 samples of thyroid tumors, 14 benign and 16 malignant ones, always compared to adjacent non-tumoral samples. Scintigraphic findings showed that 100% of malignant tumors and 87.5% of benign ones were ?cold?. RT-PCR data revealed lower gene expression in 78.6% of the benign tumors, 81.2% of the carcinomas using PSMC6 as a housekeeping gene and 100% of the carcinomas using GHPDH as a housekeeping gene, when paired to the normal tissue samples. Immunohistochemical staining revealed presence of NIS protein in 100% of the nontumoral samples, 100% of the benign tumors and 93.75% of the malignant tumors. No statistical differences were detect in this data. NIS protein was identified at basolateral membrane in 23.3% of non-tumoral samples, 14.3% of benign tumors and 12.5% of malignant tumors. No statistical differences were detect in this data...

Expressão gênica diferencial de fibroblastos de linfonodos comprometidos ou não comprometidos de pacientes com câncer de mama após cultura isolada ou co-cultura com células epiteliais mamárias normais ou malignas / Differential gene expression of fibroblasts from involved or uninvolved lymph nodes from breast cancer patients cultured alone or cocultured with normal or malignant mammary epithelial cells

As interações epitélio-mesênquima podem influenciar o desenvolvimento do tumor no sítio primário e no linfonodo comprometido de pacientes com câncer de mama. Nosso objetivo foi avaliar a taxa de proliferação e perfil gênico de fibroblastos de linfonodos comprometidos e não comprometidos obtidos de pacientes com câncer de mama e determinar a influência de células epiteliais mamárias normais (MCF10A) ou malignas (MDA-MB-231) na expressão gênica destes fibroblastos. Foram estabelecidas culturas primárias de fibroblastos de linfonodos (3 comprometidos e 3 não comprometidos) de 6 diferentes pacientes com câncer de mama e não houve diferença na taxa de proliferação destes fibroblastos. Co-culturas de células MCF10A ou MDA-MB-231 com fibroblastos, separadas fisicamente por membranas porosas, foram realizadas por 72 horas. O RNA total dos fibroblastos foi extraído, amplificado e o perfil gênico foi analisado usando-se uma lâmina de cDNA microarray. Fibroblastos de linfonodos comprometidos e não comprometidos apresentaram perfil gênico similar, pois apenas 13 genes foram modulados, sendo que maior expressão de PGBD3 e PTBP2 em fibroblastos de linfonodos comprometidos foi confirmada em ensaios de RT-PCR em tempo real. Em fibroblastos, a cocultura com células MCF10A alterou a expressão de maior número de genes que a co-cultura com células MDA-MB-231. Em fibroblastos originários de linfonodos não comprometidos mantidos em co-cultura com células MDA-MB-231 foram modulados 151 genes, em relação aos mesmos fibroblastos cultivados na ausência de células epiteliais, sendo que oito deles apresentaram variação de expressão superior a três vezes (BET1, ENTPD1, USP7, DAPK1, ERBB2 e NCF2). As células MDA-MB-231 modularam algumas vias de sinalização em fibroblastos não comprometidos, como vias do cálcio, insulina, hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH) e da regulação do citoesqueleto de actina, mas o mesmo não ocorreu em fibroblastos de linfonodos comprometidos...

Tumor development may be influenced by epithelial-mesenchimal interactions in the primary site as well as in the involved lymph node from breast cancer patients. Our aim was to evaluate the proliferation rate and gene profile of fibroblasts obtained from involved and uninvolved lymph nodes from breast câncer patients and to determine the influence of normal (MCF10A) or malignant (MDA-MB-231) mammary epithelial cells on the gene expression of these fibroblasts. Primary culture from fibroblasts obtained from 3 involved and 3 uninvolved lymph nodes (ILF and NILF) from 6 different breast cancer patients was established and no difference in their proliferation rate was detected. These fibroblasts were co-cultured with MCF10A or MDA-MB-231 cells, physically separated by a porous membrane for 72 hours. Total RNA was extracted from the cells, amplified and the gene profile from fibroblasts cultured alone or with epithelial cells was analyzed by cDNA microarray slides. Fibroblasts from involved and uninvolved lymph nodes present a similar gene profile as only 13 genes were differentially expressed between them, including PGBD3 and PTBP2, which higher expression in fibroblasts from involved lymph nodes was confirmed by real time RT-PCR. In fibroblasts, more genes seem to be regulated upon co-cultured with MCF10A than with MDA-MB-231 cells. In fibroblasts from uninvolved lymph nodes co-cultured with MDA-MB-231 cells, 151 genes were modulated as compared with fibroblasts cultured alone, and eight of them, presented an expression variation superior to three times (BET1, ENTPD1, USP7, DAPK1, ERBB2 e NCF2). In these fibroblasts, MDA-MB-231 could modulate some signaling pathways as calcium, insulin, gonadotrophin releasing hormone (GnRH) and actin cytoskeleton regulation signaling pathways...