Implicación de las conexinas, integrinas y cilio primario en la actividad de las células óseas / Involvement of connexins, integrins and primary cilium in the activity of bone cells

Introducción: los osteocitos son capaces de detectar diferentes señales, transducirlas en respuestas biológicas y trasmitirlasa los osteoblastos y osteoclastos, permitiendo el mantenimiento de la homeostasis ósea. La mecanotransducción ósea esposible gracias a que los osteocitos presentan diferentes estructuras mecanosensoras como las conexinas (Cx), las integrinas,el cilio primario e incluso receptores acoplados a proteínas G como el receptor de la parathormona tipo 1 (PTH1R).Objetivo: analizar la posible interacción de los diferentes elementos mecanosensores de los osteocitos y ver su influen-cia en la respuesta biológica.Material y métodos: se trabajó con las líneas celulares osteocíticas MLO-Y4 Cx43+/+ (scrambled (SCR) y ARNi α2) yCx43-/-.Resultados y conclusión: los resultados obtenidos muestran que la Cx43 y la integrina α2 se encuentran involucradas enel aumento de la longitud del cilio primario, afectando potencialmente a su funcionalidad como mecanosensor (SCR vs.ARNi α2, p < 0,0001 SCR vs. Cx43-/- y p < 0,0001 ARNi α2 vs. Cx43-/-). La integrina α2 también influyó en la localizacióncelular de Cx43 promoviendo que esta se encuentre en la membrana plasmática. También se observó que la activación dePTH1R por agonistas como parathormona (PTH) y proteína relacionada con la parathormona (PTHrP) inducen la fosforilaciónde la quinasa ERK 1/2, y estos efectos podrían verse afectados por la deficiencia en Cx43, pero no parecen ser mediadospor el silenciamiento de integrina α2. Finalmente, se observó que la presencia de la Cx43 y de integrina α2 en los osteoci-tos aumenta su capacidad de adhesión (Cx43+/+ SCR y ARNi α2 vs. CX43-/- p < 0,001 y p = 0,0039) y que la deficienciaen Cx43 provoca un incremento de la mortalidad de estas células (Cx43-/- vs. Cx43+/+ p = 0,0074).(AU)

El secretoma de los osteocitos estimulados mecánicamente modula la función de las células mesenquimales / The secretome of mechanically stimulated osteocytes modulates the function of mesenchymal cells

El esqueleto es un órgano metabólicamente activo que se remodela continuamente a la largo de nuestra vida. Estaremodelación implica un equilibrio entre la formación de hueso llevada a cabo por los osteoblastos y la resorción porlos osteoclastos. Los osteocitos son los encargados de regular estos dos procesos y su estimulación mecánica, es esen-cial para mantener el buen funcionamiento óseo y prevenir enfermedades como la osteoporosis. La estimulación de lososteocitos provoca una alteración en la producción y secreción de moléculas de señalización que regulan la actividadde los osteoblastos y los osteoclastos. Las células madre mesenquimales han sido propuestas como posible terapiacelular para la regeneración de distintos tejidos, incluido el tejido óseo. Hipotetizamos en el presente estudio que elsecretoma de células osteocíticas de ratón estimuladas mecánicamente afecta a la capacidad proliferativa, adhesiva ya la expresión génica de células mesenquimales indiferenciadas y células mesenquimales preosteoblásticas. Para ello,se analizaron los procesos biológicos mencionados en líneas continuas celulares preosteoblásticas y células mesenqui-males de ratón en presencia del medio condicionado por células osteocíticas MLO-Y4, después de ser sometidas aestímulo mecánico por flujo de fluido. Se observó que la proliferación aumentó en ambas líneas celulares en presenciadel secretoma de osteocitos estimulados mecánicamente frente al control, mientras que osteocitos no mecanoestimu-lados provocaban su disminución. También se observó un aumento en la capacidad adhesiva de células C3H/10T1/2 trasla estimulación con el secretoma de osteocitos mecanoestimulados. En cuanto a la expresión de genes, solo el factoradipogénico PPARᵞ sufrió alteraciones en células MC3T3-E1 por el secretoma de osteocitos. Estos estudios indican quelos osteocitos pueden modificar el comportamiento biológico de células mesenquimales mediante la secreción de factores solubles.(AU)

Implicación de la Cx43 y el cilio primario en la actividad de los osteocitos / Cx43 and primary cilium involvement in osteocyte activity

Objetivo: El tejido óseo tiene la capacidad de adaptarse a los estímulos del entorno alterando su morfología y metabolismo. Las diferentes células óseas se comunican entre sí a través de uniones comunicantes (UCs). La conexina 43 (Cx43) es la proteína más abundante de las UCs; tiene funciones clave en la transducción de señales y en la respuesta a estímulos hormonales y mecánicos. Otro elemento mecanosensor de los osteocitos es el cilio primario, formado por microtúbulos y que se desarrolla en la fase G0 del ciclo celular. Los objetivos de este estudio fueron determinar la implicación de la Cx43 y del cilio primario en la actividad de los osteocitos, analizar la posible interacción entre estos dos mecanosensores, y evaluar el papel que desempeñan en la detección y respuesta de los osteocitos ante el estímulo mecánico y la estimulación del receptor de la parathormona tipo 1 (PTH1R) por su ligando, la proteína relacionada con la parathormona (PTHrP) (1-36). Material y métodos: Se comparó la línea celular de osteocitos MLO-Y4 control (Cx43+/+) con MLO-Y4 deficientes en Cx43 (Cx43-/-). El análisis de expresión de la proteína del transporte intraflagelar 88 (IFT88), de la Cx43 y de la fosforilación de la quinasa reguladora de la señal extracelular (P-ERK) se determinó mediante Western blot. Para caracterizar la posible colocalización entre el cilio primario y Cx43 se realizó una inmunofluorescencia. Para simular el estímulo mecánico in vitro, las células se sometieron a un estrés mecánico de 10 dinas/cm2 por flujo de fluido durante 10 minutos. Resultados: Los resultados obtenidos muestran que el número de células con cilio primario no varía por la expresión de Cx43 (p=0,089); y que en las células con presencia en Cx43, el estímulo mecánico por flujo de fluido y la PTHrP aumentan la fosforilación de quinasas reguladas por señal extracelular (ERK) respecto a las células no estimuladas (p=0,049 y p=0,011, respectivamente). (AU)

Objetivo: Bone tissue can adapt to environmental stimuli by altering its morphology and metabolism. Different bone cells communicate with each other through communicating junctions (CJs). Connexin 43 (Cx43) is the most abundant CJ protein with key functions in signal transduction and in response to hormonal and mechanical stimuli. Another mechanosensor element of osteocytes is the primary cilium, formed by microtubules and which develops in the cell cycle’s G0 phase. Our study aims to determine Cx43 and primary cilium involvement in osteocytic activity, to analyze the possible interaction between these two mechanosensors and to assess the role they play in the detection and response of osteocytes to mechanical stimuli and stimulation of the parathormone type 1 receptor (PTH1R) by its ligand, the parathormone-related protein (PTHrP) (1-36). Material and methods: The control MLO-Y4 (Cx43 +/+) osteocyte cell line was compared to Cx43-deficient MLO-Y4 (Cx43 -/-). The expression analysis of intraflagellar transport protein 88 (IFT88), Cx43 and phosphorylation of the extracellular signal regulatory kinase (P-ERK) was determined by Western blot. To characterize the possible colocalization between the primary cilium and Cx43, an immunofluorescence was carried out. To simulate mechanical stimulation in vitro, cells were subjected to mechanical stress of 10 dynes/cm2 by fluid flow for 10 minutes. Results: The results obtained show that the number of cells with primary cilium does not vary due to the expression of Cx43 (p = 0.089). In cells with Cx43 presence, mechanical stimulation by fluid flow and PTHrP increase the phosphorylation of extracellular signal-regulated kinases (ERK) compared to unstimulated cells (p = 0.049 and p = 0.011, respectively). (AU)

In vitro chondral culture under compression and shear stimuli. From mesenchymal stem cells to hyaline cartilage. / Cultivo condral in vitro bajo estímulos de compresión y cizallamiento. De las células troncales mesenquimales al cartílago hialino.

INTRODUCTION: The in vitro creation of hyaline joint cartilage is a challenge since, to date, the ex vivo synthesis of a structured tissue with the same biomechanical and histological properties of the joint cartilage has not been achieved. To simulate the physiological conditions we have designed an in vitro culture system that reproduces joint movement. MATERIAL AND METHOD: We have developed a cell culture bioreactor that prints a mechanical stimulus on an elastin matrix, in which mesenchymal stem cells (MSC) are embedded. The first phase of study corresponds to the development of a bioreactor for hyaline cartilage culture and the verification of cell viability in the elastin matrix in the absence of stimulus. The second phase of the study includes the MSC culture under mechanical stimulus and the analysis of the resulting tissue. RESULTS: After culture under mechanical stimulation we did not obtain hyaline tissue due to lack of cellularity and matrix destructuring. CONCLUSION: The stimulus pattern used has not been effective in generating hyaline cartilage, so other combinations should be explored in future research.