Identificação e validação funcional de novos alvos das PKCs em célula tronco embrionária / Identification and functional validation of new targets of PKC in embryonic stem cell

Algumas das estratégias utilizadas para entender a biologia de células tronco embrionária (CTE) são baseadas na identificação de cascatas de sinalização que induzem a diferenciação e auto-renovação das CTE através da interferência seletiva de processos específicos. A família das proteínas quinase C (PKC) é conhecida por participar dos processos de auto-renovação e diferenciação celular em CTE, entretanto, o papel específico das diferentes isoenzimas das PKCs ainda precisa ser elucidado. Desta forma investigamos. o papel das PKCs atípicas (aPKCs) em CTE indiferenciadas utilizando um inibidor específico para estas serina/ treonina quinases, o peptídeo pseudossubstrato das aPKCs, e fosfoproteômica. A maioria das proteinas identificadas cuja fosforilação reduziu após o tratamento com o inibidor das aPKC, são proteínas envolvidas com o metabolismo principalmente com a via glicolítica. Além disso, a inibição das aPKCs levou a redução do consumo de glicose, secreção de lactato, acompanhada da redução da atividade da lactato desidrogenase, e aumento da fosforilação oxidativa, sendo analisada através do consumo de oxigênio após o tratamento com oligomicina e FCCP. Verificamos também que as aPKCs são capazes de fosforilar diretamente a piruvato quinase. A glicólise aeróbica parece ser fundamental para a manutenção da indiferenciação das CTE, e demonstramos que as aPKCs participam deste processo auxiliando na auto-renovação das CTE indiferenciadas. Também observamos que as aPKCs assim como a PKCßI modulam a fosforilação da α-tubulina, porém ao passo que as aPKCs interagem com a α-tubulina durante a interfase, a PKCßI interage com a mesma apenas durate a mitose. Estes resultados motivaram a segunda parte da tese, na qual o papel da fosforilação da α-tubulina pela PKCßI foi investigado. O resíduo de treonina 253, conservado em diversas espécies de vertebrados e localizado na interface de polimerização entre a α- e a ß-tubulina foi identificado, como um novo sítio de fosforilação da α-tubulina pela PKCßI. Este sítio não está em um consenso linear para a PKC, entretanto é um consenso formado estruturalmente, onde aminoácidos básicos distantes na sequência linear se tornam justapostos na estrutura terciária da proteína. Estudos de simulação por dinâmica molecular demonstraram que a interação entre a α e ß-tubulina aumenta após esta fosforilação, uma vez que T253 fosforilada passa a interagir com K105, um residuo conservado na ß-tubulina. A fosforilação in vitro de α-tubulina aumenta a taxa de polimerização da tubulina e a inibição da PKCßI em células reduziu a taxa de repolimerização do microtubulo após o tratamento com nocodazol. Além disso, a importância da fosforilação deste sítio foi demonstrada pelo fato de que um mutante fosfomimético GFP-α-tubulina, T253E ser mais incorporado no fuso mitótico ao passo que T253A foi menos incorporado do que a proteína selvagem. Nossos dados suportam a hipótese que os consensos estruturais formados podem ser importantes sítios de reconhecimento pelas quinases e que a fosforilação de T253 da α-tubulina afeta a estabilidade do polímero. Em conclusão, utilizando métodos de fosfoproteômica e interferência seletiva de vias de sinalização, combinados a validações experimentais dos alvos identificados podemos propor a importância funcional das aPKCs e PKCßI em CTE indiferenciadas

Some of the strategies used to understand stem cell biology are based on the identification of signalling cascades that lead to differentiation and self-renewal of embryonic stem cells (ESC) by selective interference of specific signalling processes. The protein kinase C (PKC) family is known to participate in ESC self-renewal and differentiation, however, the specific role of the different PKC isoenzymes in these cells remains to be determined. Therefore, we investigated the role of atypical PKCs (aPKC) in undifferntiated ESC using a specific inhibitor for these serine/ threonine kinases, pseudo-substrate peptide of aPKCs, and phosphoproteomics. The majority of proteins whose phosphorylation decreased upon aPKC inhibition, are proteins involved in metabolism in particular with the glycolytic pathway. Besides that, inhibiton of aPKCs led to a decrease in glucose uptake and lactate secretion, followed by a decrease in lactate dehydrogenase activity, and an increase in mitochondrial activity as measured by oxygen consumption after treatment with olygomycin and a chemical uncoupler. We also verified that aPKCs are able to directly phosphorylated pyruvate kinase. Aerobic glicolysis seems to be fundamental for the maintainance of undifferentiated ESC, and we demonstrated that aPKCs participte in these processes helping to maintain self-renewal of undifferentiated ESC. We also observed that aPKCs as PKCßI modulate the phosphorylation of α-tubulin, however, while aPKCs interact with α-tubulin during interfase PKCßI interacts with α-tubulin only during mitosis. These results lead to the second part of this thesis. We investigated the role of α-tubulina phosphorylation by PKCßI. Indentifying threonine 253, a conserved residue in several vertebrate species, of localized at the polymerization interface between α- and ß-tubulin, as a phosphorylation site of α-tubulin by PKCßI. This site is not in a linear consensus for PKC, however, it is in a structuraly formed consensus, where basic aminoacids distant in the linear sequence are juxtaposed in the three dimentional protein structure. Simulation studies by molecular dynamics show that the interaction between α and ß-tubulin increases upon this phosphorylation, once, phosphorylated T253 interacts with com K105, a conserved residue in ß-tubulin. The in vitro phosphorylation of α-tubulin increased tubulin polymerization rate and inhibiton of PKCßI in cells reduced repolimeration rate of microtubles upon treatment with nocodazole. Besides that, the importance of this phosphorylation site were demonstrated by the fact that a phosphomimetic mutant GFP-α-tubulina, T253E is more incorporated in mitotic fuses while T253A is less than wild type. Our data support the hypothesis that structural consensus may be important sites recognized and that T253 phosphorylation of α-tubulin afects the polymer stability. In conclusion, using phosphoproteomics methods and selective interference of signal transduction pathways combined with experimental validation studies of the identified targets we can propose roles for aPKCs and PKCßI in undifferentiated ESC

Diferenciação de células-tronco embrionárias murinas (mESCs) em células produtoras de insulina (IPCs) e caracterização funcional do gene Purkinje cell protein 4 (Pcp4) neste processo / Differentiation of murine embryonic stem cells (mESCs) into insulin-producing cells (IPCs) and functional characterization of the Purkinje Cell Protein 4 (Pcp4) gene in this process

Fontes alternativas de células ß têm sido estudadas para o tratamento de Diabetes mellitus tipo 1, dentre as quais a mais promissora consiste das células-tronco diferenciadas em células produtoras de insulina (IPCs). Alguns trabalhos demonstram a capacidade de células-tronco embrionárias murinas (mESCs) de formarem estruturas semelhantes a ilhotas pancreáticas, porém, os níveis de produção de insulina são insuficientes para a reversão do diabetes em camundongos diabetizados. Este trabalho visa desenvolver um protocolo adequado para geração de IPCs e contribuir para a identificação e caracterização funcional de novos genes associados à organogênese pancreática. Logo no início da diferenciação das mESCs em IPCs, foi possível verificar o surgimento de células progenitoras, evidenciado pela expressão de marcadores importantes da diferenciação beta-pancreática. Ao final do processo de diferenciação in vitro, ocorreu a formação de agrupamentos (clusters) semelhantes a ilhotas, corando positivamente por ditizona, que é específica para células ß-pancreáticas. Para avaliar seu potencial in vivo, estes clusters foram microencapsulados em Biodritina® e transplantados em camundongos diabetizados. Apesar dos níveis de insulina produzidos não serem suficientes para estabelecer a normoglicemia, os animais tratados com IPCs apresentaram melhores condições, quando comparados ao grupo controle, tendo melhor controle glicêmico, ganho de massa corpórea e melhor aparência da pelagem, na ausência de apatia. Além disso, análise dos clusters transplantados nestes animais indicou aumento da expressão de genes relacionados à maturação das células ß. Porém, quando estes clusters foram microencapsuladas em Bioprotect® e submetidos à maturação in vivo em animais normais, ocorreu um aumento drástico na expressão de todos os genes analisados, indicando sua maturação completa em células beta. O transplante destas células completamente maturadas em animais diabetizados, tornou-os normoglicêmicos e capazes de responder ao teste de tolerância à glicose (OGTT) de forma semelhante aos animais normais. A segunda parte do trabalho visou analisar genes diferencialmente expressos identificados em estudo anterior do nosso grupo, comparando, através de DNA microarray, mESCs indiferenciadas e diferenciadas em IPCs. Um dos genes diferencialmente expressos é aquele que codifica para a Purkinge cell protein 4 (Pcp4), sendo 3.700 vezes mais expresso em IPCs. Para investigar o possível papel do gene Pcp4 em células ß e no processo de diferenciação ß-pancreática, adotou-se o enfoque de genômica funcional, superexpressando e inibindo sua expressão em células MIN-6 e mESCs. Apesar da alteração na expressão de Pcp4 em células MIN-6 não ter interferido de forma expressiva na expressão dos genes analisados, quando inibido, modificou o perfil da curva de crescimento celular, aumentando seu tempo de dobramento de forma significativa e diminuindo da viabilidade celular em ensaios de indução de apoptose. Já na diferenciação de mESCs em IPCs, a superexpressão de Pcp4 interferiu de forma positiva apresentando uma tendência a aumentar a expressão dos genes relacionado à diferenciaçãoß-pancreática. Concluindo, desenvolvemos um novo protocolo de diferenciação de mESCs em IPCs as quais foram capazes de reverter o diabetes em camundongos diabetizados e descrevemos, pela primeira vez, o gene Pcp4 como sendo expresso em células ß-pancreáticas, podendo estar relacionado à manutenção da viabilidade celular e maturação destas células

New cellular sources for type 1 Diabetes mellitus treatment have been previously investigated, the most promising of which seems to be the insulin producing cells (IPCs), obtained by stem cells differentiation. Some reports show that murine embryonic stem cells (mESCs) are able to form islet-like structures, however, their insulin production is insufficient to render diabetic mice normoglycemic. This work aims at developing an adequate protocol for generation of IPCs and searching for new genes which could be involved in the pancreatic organogenesis process. Early on during mESCs differentiation into IPCs, we observed the presence of progenitor cells, which were able to express pancreatic ß-cell markers. At the end of the differentiation process, the islet-like clusters positively stained for the insulin-specific dithizone. These clusters were microencapsulated in Biodritin® microcapsules, and then transplanted into diabetized mice. Although the levels of insulin production were insufficient for the animals to achieve normoglycemia, those which received IPCs displayed improved conditions, when compared to the control group, as judged by a better glycemic control, body weight gain and healthy fur appearance, in the absence of apathy. In addition, when these transplantated clusters were retrieved, high levels of expression of the genes related to ß-cell maturation were detected. IPCs were also microencapsulated in Bioprotect® and subjected to in vivo maturation in normal animals. A dramatic increase of the analyzed genes expression was observed, indicating complete maturation of the differentiated cells. When these cells were transplanted into diabetized mice, these animals achieved normoglycemia and were able to display glucose tolerance test (OGTT) response very similar to that of normal mice. In the second part of this work, we analyzed upregulated genes described in previous work from our group, comparing undifferentiated mESCs to IPCs using a microarray platform. One of these genes is that coding for the Purkinje cell protein 4 (Pcp4), which is 3,700 more expressed than in undifferentiated mESC cells. We adopted a functional genomics approach to investigate the role played by the Pcp4 gene in ß-cells and in ß-cell differentiation, by inducing overexpression and knocking down this gene in MIN-6 and mESC cells. Although the differential expression of Pcp4 in MIN-6 was not able to interfere with the expression of the genes analyzed, we observed different cell growth rates, with increased doubling time and decreased cell viability when its expression was knocked down. In addition, overexpression of Pcp4 in mESCs subjected to differentiation into IPCs apparently increases the expression of genes related to ß-cell differentiation. In conclusion, we developed a new protocol for ESCs differentiation into IPCs, which is able to revert diabetes in diabetized mice, and we also describe here, for the first time, the Pcp4 gene as being expressed in pancreatic ß-cells and possibly being related to maintenance of cell viability and ß-cell maturation