Estudio del riesgo cardiovascular en pacientes con bloqueo del sistema renina-angiotensina a través del proteoma de las vesículas extracelulares circulantes / Cardiovascular risk study in patients with renin-angiotensin system blockade by means of the proteone of circulating extracellular vesicles

Introducción: Las vesículas extracelulares (EV) son liberadas al torrente circulatorio por determinados tipos celulares a consecuencia de procesos de transporte, activación o muerte celular. El recuento de EV circulantes de origen plaquetario y endotelial ha demostrado tener un importante papel como biomarcador de riesgo cardiovascular. Por lo tanto, el proteoma de estas EV podría reflejar los procesos celulares subyacentes en pacientes con hipertensión arterial y albuminuria. Material y métodos: El contenido proteico de las EV circulantes se ha analizado mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas. Las EV han sido aisladas mediante un protocolo de ultracentrifugación optimizado para evitar la contaminación de proteínas del plasma. La pureza de la fracción aislada ha sido verificada mediante microscopia electrónica y confocal, y por citometría de flujo. Resultados: En este estudio mostramos un método de gran rendimiento y pureza para obtener extractos proteicos de EV circulantes de pacientes hipertensos con/sin albuminuria para análisis proteómico. Además, aportamos el proteoma de referencia de EV de estos pacientes, compuesto por 2.463 proteínas, y demostramos que las proteínas transportadas por estas vesículas están relacionadas con procesos cruciales involucrados en el riesgo cardiovascular asociado. Conclusión: El proteoma de las EV circulantes constituye una interesante fuente de indicadores para la evaluación de procesos relacionados con el riesgo cardiovascular en pacientes hipertensos con bloqueo del sistema renina-angiotensina

Introduction: Extracellular vesicles (EVs) are released to the bloodstream by certain cell types due to transport, activation and cell death processes. Blood count of EVs from platelet and endothelial origin has been proved to be a cardiovascular risk biomarker. Thus, EVs proteome might reflect the underlying cellular processes in hypertensive patients with albuminuria. Material and methods: Protein content of circulating EVs was analyzed by liquid chromatography coupled to mass spectrometry. EVs were isolated by an ultracentrifugation protocol optimized in order to avoid contamination by blood plasma proteins. Purity of the isolated fraction was verified by electronic and confocal microscopy, and by flow cytometry. Results: We hereby show a method to isolate circulating EVs from hypertensive patients with/without albuminuria with high yield and purity. Besides, we provide a reference proteome of the EVs of these patients, composed of 2,463 proteins, and prove that the proteins carried by these vesicles are associated with crucial processes involved in the inherent cardiovascular risk. Conclusion: The proteome of circulating EVs is an interesting source of indicators in the evaluation of cardiovascular risk in hypertensive patients with renin-angiotensin system blockage

Oxidative nanopatterning of titanium surfaces promotes production and extracellular accumulation of osteopontin

The bone-biomaterial interface has been characterized by layers of afibrillar extracellular matrix (ECM) enriched in non collagenous proteins, including osteopontin (OPN), a multifunctional protein that in bone controls cell adhesion and ECM mineralization. Physical and chemical aspects of biomaterial surfaces have been demonstrated to affect cell-ECM-substrate interactions. The present paper described the ability of oxidative nanopatterning of titanium (Ti) surfaces to control extracellular OPN deposition in vitro. Ti discs were chemically treated by a mixture of H2SO4/H2O2 for either 30 min [Nano(30') Ti] or 4 h [Nano(4h) Ti]. Non-etched Ti discs were used as control. Primary osteogenic cells derived from newborn rat calvarial bone were plated on control and etched Ti and grown under osteogenic conditions up to 7 days. High resolution scanning electron microscopy revealed that treated Ti discs exhibited a nanoporous surface and that areas of larger nanopits were noticed only for Nano(4h) Ti. Large extracellular OPN accumulation were detectable only for Nano(4h) Ti, which was associated with OPN-positive cells with typical aspects of migrating cells. At day 3, quantitative results in terms of areas of OPN labeling were as follows: Nano(4h) Ti > Nano(30') Ti > Control Ti. In conclusion, chemically nanostructured Ti surfaces may support the enhancement of endogenous extracellular OPN deposition by osteogenic cells in vitro depending on the etching time, a finding that should be taken into consideration in strategies to biofunctionalize implant surfaces with molecules with cell adhesion capacity.

A interface osso-implante é caracterizada pela presença de uma camada de matriz extracellular (MEC) afibrilar rica em proteínas não-colágenas, incluindo osteopontina (OPN), cujas funções no tecido ósseo estão relacionadas à adesão celular e ao controle do processo de mineralização da MEC (crescimento de cristais). Aspectos físicos e químicos das superfícies de biomateriais podem afetar as interações célula-MEC-substrato. O objetivo do presente estudo foi demonstrar a capacidade de aspectos nanotopográficos de superfície de titânio (Ti) de controlar a deposição extracelular de OPN in vitro. Discos de Ti foram tratados quimicamente por solução de H2SO4/H2O2 durante 30 min [Nano(30') Ti] ou 4 h [Nano(4h) Ti]. Superfícies de Ti não tratadas foram usadas como controle. Células osteogênicas primárias derivadas de calvárias de ratos recém-nascidos foram plaqueadas sobre os discos de Ti e cultivadas em condições osteogênicas por até 7 dias. Microscopia eletrônica de varredura de alta resolução revelou que os discos de Ti tratados quimicamente exibiam superfície nanoporosa, com áreas de nanoporos maiores para Nano(4h) Ti. Apenas para esse grupo detectavam-se acúmulos extensos de OPN extracelular, os quais se distribuíam em áreas adjacentes a células OPN-positivas, com aspectos morfológicos típicos de células em migração. Em conclusão, a nanoestruturação química de superfície de Ti pode favorecer o aumento da deposição extracelular de OPN endógena por células osteogênicas in vitro, dependendo do tempo de condicionamento utilizado, o que deve ser considerado no desenvolvimento de estratégias para funcionalizar superfícies de implantes com moléculas com reconhecido efeito no processo de adesão celular.

Desarrollo de un protocolo de análisis de la expresión génica mediante «differential display» que reduce el número de falsos positivos / The development of a protocol for the analysis of genetic expression through «differential display», as a means to reducing the number of false positives

Entre los métodos empleados para los análisis de la expresión de genes, el método de "differential display" ha sido ampliamente utilizado y, a pesar del uso extendido de los "microarrays", es aún un método válido para el análisis con muestras cuyo transcriptoma es desconocido. Con el objeto de reducir el elevado número de falsos positivos que genera esta técnica, hemos optimizado el protocolo para reducir la posibilidad de generar falsos positivos. En primer lugar, hemos marcado radiactivamente el cebador oligo-dT con lo que los fragmentos de DNA identificados son extremos 3'-UTR de RNAm. Por muestra hemos realizado dos transcripciones inversas y dos reacciones de PCR en cada una de ellas. Para seleccionar un fragmento de DNA, debía estar diferencialmente expresado en las 4 reacciones de PCR. Por último, todos los fragmentos fueron clonados y secuenciados por triplicado. Estas modificaciones al protocolo nos ha permitido identificar 5 genes expresados diferencialmente entre células epiteliales de intestino en estado proliferativo y diferenciado

The analysis of genetic expression, the differential display (DD) method has been widely used, but inspite of the extensive use of the «microarrays» method, it is still to be considered as a valid method for the analysis of samples whose transcriptone is not known. In this work, an attempt has been made to reduce the high number of false positives generated by this technique by optimising method protocol. As a preliminary step, we radioactively marked the oligo dT primer with which the fragments of identified DNA were extreme 3'-UTR of mRNA. For each sample two inverse transcriptions and two PCR reactions were performed. Only fragments of DNA that are expressed differentially in all 4 PCR reactions should be selected. Finally, all of the fragments were cloned and sequenced in triplicate. These protocol modifications have allowed us to identify 5 differentially expressed genes, in intestinal epithelial cells in both proliferative and differentiated states